Основные реагенты кондуктометрических анализаторов

Основными составляющими комплектов реагентов для кондуктометрических гематологических анализаторов являются:

• а) изотонический разбавитель; б) лизирующий раствор;
• А) Изотонический разбавитель — это буферный раствор с фиксированными параметрами рН, электропроводности и осмолярности. Слово «изотонический» указывает только на одно и не самое важное свойство реагента — поддержание требуемого осмотического давления с целью обеспечения постоянства объема клеток крови. Дело в том, что эритроциты принимают тот объем, который им диктует осмолярность раствора. При увеличении осмолярности эритроциты сжимаются до некоторого равновесного объема. Если осмолярность раствора уменьшается, объем эритроцитов, соответственно, увеличивается. Таким образом, средний объем эритроцитов (MCV) увязывается с осмолярностью изотонического разбавителя. Стабилизирующие добавки в изотоническом разбавителе должны обеспечивать сохранность форменных элементов крови в течение достаточно длительного. Присутствие в растворе антикоагулянта должно эффективно предотвращать образование фибриновых сгустков и агрегацию тромбоцитов. В случае гематологических анализаторов, проводящих дифференциацию лейкоцитов на три популяции, изотонический разбавитель содержит специальные добавки, модифицирующие мембраны лейкоцитов.
• Б) Лизирующий раствор — гемолитик, который при добавлении в разведение крови приводит к лизису эритроцитов и в то же время сохраняет лейкоциты.

Необходимо, чтобы гемолиз эритроцитов был качественный, поскольку в гемолизате подсчитываются лейкоциты, которых первоначально примерно в 1000 раз меньше, чем эритроцитов. Для обеспечения этих свойств лизирующий раствор, как правило, содержит сложную композицию ионных поверхностно-активных соединений.

Высокотехнологические гематологические анализаторы

Высокотехнологические гематологические анализаторы способны осуществлять дифференцированный счет лейкоцитов по 5-ти (5Diff) основным популяциям, используя различные принципы дифференцирования клеток: нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты и лимфоциты, оценивать наличие незрелых гранулоцитов, анализировать ретикулоциты и их субпопуляции, проводить оценку стволовых гемопоэтических клеток и субпопуляций лимфоцитов. Многочисленные функции современных гематологических анализаторов стали возможны, благодаря развитию новых технологий, которые отличаются у разных фирм-производителей.

В анализаторах фирмы Bekman-Coulter (LH 500, LH750) (США — Франция) используется трехмерный анализ дифференцировки лейкоцитов (VCS-технология), который включает в себя одновременный компьютерный анализ клеток по объему (Volume), электропроводности (Conductivity) и дисперсии лазерного света (Scatter).

Полученные по трем каналам данные с помощью электроники комбинируются и анализируются, в результате чего происходит распределение клеток по дифференцировочным кластерам и, таким образом, лейкоциты разделяются на пять основных популяций: лимфоциты, моноциты, нейтрофилы, эозинофилы и базофилы. Результатом отображения объемного графика на плоскости является лейкоцитарная скатерограмма, на которой каждый тип клеток имеет свою зону расположения.

В анализаторах серии Cell-Dyn для дифференцировки лейкоцитов применяется технология MAPSS — Multi Angle Polarized Scatter Separation — мультипараметрическая система лазерного светорассеивания — регистрация интенсивности рассеивания клетками поляризованного лазерного луча под разными углами. Этот метод заключается в компьютерном анализе дисперсии лазерного счета клетками крови. Рассеивание клеткой поляризованного лазерного луча под разными углами дает сведения о таких ее свойствах, как:

• — размер клеток — для чего оценивается прохождение поляризованного лазерного луча под малым углом рассеивания (близким к 0 град.);
• — структура и степень сложности клеток — оценивается по анализу рассеивания поляризованных лазерных лучей, направленных под углом до 7 град.;
• — ядерно-цитоплазматическое соотношение — оценивается по анализу рассеивания поляризованных лазерных лучей, направленных под углом до 10 град.;
• — оценка формы клеточного ядра — осуществляется благодаря анализу светорассеивания поляризованных лазерных лучей под углом 90 град.;
• — для оценки клеточной зернистости и дифференцировки эозинофилов используется оценка светорассеивания деполяризованного луча под углом 90 град.

В гематологических анализаторах серии XT и ХЕ фирмы Sysmex применяется метод проточной цитофлюориметрии с использованием флюоресцентного красителя полиметина.

Флюоресцентный краситель связывается с ДНК и РНК неизмененных клеток. Анализ клеток происходит в проточной кювете при пересечении луча лазера длиной 633 нм. После контакта лазерного луча с окрашенной клеткой происходит рассеивание последнего под большим и малым углами и возбуждение флюоресцентного красителя. Данные сигналы улавливаются фотоумножителями и регистрируются в виде трех параметров:

• 1. Светорассеивание под малым углом (FSC) — отклонение лазерного луча под малым (до 10 град.) углом, которое зависит от размера (объема, только при условии сферической формы частицы) и формы клетки;
• 2. Боковое светорассеивание (SSC) — рассеивание под углом до 90 град. зависит от рефрактерного индекса (или плотности) клетки и характеризует сложность внутриклеточных структур;
• 3. Детекция специфического флюоресцентного сигнала (SFL), которая регистрируется также как боковое светорассеивание под углом 90 град. и позволяет судить о содержании РНК/ДНК в клетках.

На основании полученных сигналов все клетки распределяются по соответствующим кластерам (зонам) в соответствии с их размером, структурой и количеством ДНК. Таким образом, происходит дифференцировка лейкоцитов на 4 популяции: лимфоциты, моноциты, эозинофилы и нейтрофилы вместе с базофилами.