Цитогенетический метод. 
Изучение генетики человека

Основным объектом цитогенетического метода являются субклеточные структуры, главным образом, хромосомы. В настоящее время разработаны методы для исследования молекулярных механизмов структурной организации хромосом, особенностей их функционирования в процессе жизнедеятельности, а также закономерностей изменчивости и их стабильности.

Изучение хромосом человека прошло три основных этапа.

Первый этап — поиск адекватных методических путей изучения морфологии хромосом, связан с именами таких биологов, как М.С. Нава-Шин, П. И. Живаго, А. Г. Андерс, Г. КХрущев.

Второй этап — опубликование первой работы (J.Tjio, A. Levan, 1956), в которой удалось получить картину морфологии хромосом человека и точно идентифицировать их число. Началось активное изучение морфологии митотических и мейотических хромосом в норме и после воздействия мутагенов различной природы (А.А. Прокофьева-Бельговская, 1969, E. Ford 1973). В 1959 г. Л ежен открыл хромосомную природу синдрома Дауна, а в течение последующих лет были описаны и другие, наиболее часто встречающиеся хромосомные болезни. Было показано, что значительная часть детей с пороками развития имеет хромосомные аномалии. Цитогенетика стала важной областью практической медицины.

Третий этап — начинается с разработки методов дифференциального окрашивания хромосом (B.Dutrillaux, 1975; А. Ф. Захаров, 1977). Эти методы позволили идентифицировать каждую хромосому человека, составить для них цитологическую карту линейной неоднородности. В последние годы разработаны ДНК-зонды, с помощью которых можно оценить наличие или отсутствие определенного, даже очень маленького, сегмента в хромосоме (см. раздел 4.4).

Изучение строения и функционирования хромосом человека имеет большое теоретическое и практическое значение для медицинской генетики. Знание того, что собой представляет каждая хромосома человека в химическом, цитологическом и генетическом отношении, важно для правильного понимания происхождения хромосомных нарушений и обусловленных ими отклонений.

Методы анализа хромосом Хромосомные болезни клиницисты стали изучать еще до установления точного числа хромосом человека. Например, синдромы Клайнфельтера и Шерешевского — Тернера были описаны до открытия хромосомной этиологии этого синдрома. В настоящее время для выявления наследственной патологии используют метод оценки хромосомных аберраций в лимфоцитах человека.

Препараты хромосом человека можно приготовить из любой пролиферативно активной ткани (костного мозга, собственно соединительной ткани и др.), но чаще для этой цели используют лимфоциты периферической крови. Кровь донора помещают в специальную среду, которая содержит все необходимые для роста клеток крови питательные вещества, и инкубируют в присутствии специальных веществ — митогенов, которые стимулируют лимфоциты к делению. Клетки растут в культуре в течение 72 часов, за это время лимфоциты проходят два митотических деления, после чего добавляют специальное вещество — колхицин. Колхицин ингибирует процесс формирования нитей ах-роматинового веретена, и все делящиеся клетки V останавливаются на стадии метафазы. В метафа-зе хромосомы максимально конденсированы, что позволяет хорошо их различать.

Обнаружение трисомии по 21-й хромосоме при синдроме Дауна Леженом в 1959 г. определило важность цитогенетики в медицине. Цитогенетичес-кая болезнь Дауна представлена двумя вариантами: простым (трисомным) и транслокационным. В основе болезни Дауна лежит нерасхождение по 21-й паре хромосом. Кариотип больного при три-сомном варианте содержит 47 хромосом, при этом лишней оказывается 21-я хромосома. При транслокационном варианте в кариотипе содержится 46 хромосом, причем в наборе имеются две нормальные 21-е хромосомы, одна нормальная 15-я хромосома и крупная аномальная непарная хромосома, представляющая собой соединение 21-й и 15-й хромосом. Другой формой транслокации при болезни Дауна может быть соединение между собой двух 21-х из трех, имеющихся в клетке. Трисомный вариант синдрома Дауна встречается в 95% случаев, на транслокационные формы приходится 4% и на мозаицизм 1% случаев этого синдрома. При мозаичном варианте 46/47 (норма/трисомия) выраженность симптомов зависит от соотношения клеток с генотипом 46 к клеткам с генотипом 47.

Синдромы Патау и Эдварса — два других тяжелых заболевания, связанные с аутосомной анеу-плоидией. Синдром Патау возникает при трисомии по хромосоме 13 и встречается примерно у одного из 5000 новорожденных. Наиболее характерные признаки этого заболевания — расщепление губы и неба («заячья губа», «волчья пасть»), микроцефалия, полидактилия; пороки внутренних органов включают — пороки сердца, гипоплазию мозжечка, дивертикулы и др. Синдром Патау встречается в двух цитогенетических вариантах — простая трисомия 13-й хромосомы и транслокация D/13. Синдром Эдварса возникает при трисомии по хромосоме 18. При этом синдроме нарушения нормального развития затрагивают практически все системы органов. Частота синдрома среди новорожденных составляет около 1 на 10 000. Среди заболеваний человека, сопровождающихся хромосомными нарушениями, особое место занимают злокачественные образования (см. главу 16). В 1960 г. американскими исследователями П. Ноуэллом и Д. Хангерфордом было обнаружено у больных хроническим миелолейкозом специфическое хромосомное нарушение — деления хромосомы 22 (рис. 13.6). В честь города, где было сделано это открытие, делитированная хромосома была названа «филадельфийской» и сокращенно обозначается символом «Ph1». По данным многих авторов, Ph'-хромосома встречается в клетках костного мозга в 80—100% метафаз у большинства больных хроническим миелолейкозом в любой фазе заболевания. Ph'-хромосома присутствует у больных лишь в миелоидных тканях, она очень редко обнаруживается в клетках других тканей — в культуре кожных фибробластов, в культуре лимфоцитов периферической крови.

В последние годы разработан метод цитогенетического анализа хромосом сперматозоидов человека. Сперматозоиды — высокодифференцированные клетки (не способные к делению), содержащие гаплоидный набор хромосом. Однако их генетический материал может удваиваться и вступает в митоз после оплодотворения. Для этой цели у самки золотистого хомячка вызывают суперовуляцию (с помощью гормонов), затем отбирают ооциты и соединяют со спермой человека. Сперматозоиды оплодотворяют яйцеклетки хомячка, образуется химера: человек + хомяк. Образовавшаяся зигота начинает делиться, однако эти деления различных видовых организмов несбалансированны, и через несколько часов такая химера погибает. Процесс оплодотворения стимулирует сперматозоиды к делению, и этих первых делений достаточно, чтобы накопилось определенное число митотических клеток.

На приготовленном препарате можно легко различить хромосомы человека и хромосомы золотистого хомячка. Хромосомный анализ сперматозоидов человека проводят с целью оценки генетической стабильности хромосомы, в случаях контакта с мутагенами и для выявления мужского бесплодия.

Половой хроматин Цитогенетический метод позволяет определять половой хроматин.

В клетках мужского организма Х-хромосома всегда выполняет активную функцию, у женщин одна Х-хромосома играет важную роль и определяет развитие женского пола, а вторая находится в неактивном, спирализованном состоянии (тельце Барра). Тельце Барра представляет собой маленькую хорошо окрашивающуюся структуру на внутренней поверхности ядерной мембраны соматических клеток женщин (рис. 13.7).

Присутствие Х-хроматина в норме у женщин связано с инактивацией одной из двух Х-хромосом (рис. 13.8). При любом числе хромосом в активном состоянии всегда будет только одна, другие будут образовывать тельце Барра. Следовательно, половой хроматин в норме выявляется только у женщин и отсутствует у мужчин. У женщин с кариотипом 47, XXX обнаруживаются два тельца Барра, с кариотипом 48, ХХХХ — три, а с кариотипом 45, ХО — ни одного. У мужчин с кариотипом ХХУ — одно, ХХХУ — два, ХХХХУ — три тельца Барра.

Определение Х-полового хроматина у плода помогает своевременно определить его пол. Это бывает важно для решения вопроса о дальнейшей его судьбе при диагностике наследственных заболеваний, связанных с анеуплоидиями по половым хромосомам.

Лабораторная работа Определение полового хроматина

В настоящее время разработан простой и доступный метод получения материала для определения полового хроматина — соскобы слизистой оболочки полости рта.

С целью получения соскобов проводится следующая процедура: слегка заостренным (но не острым) металлическим шпателем, который перед каждым соскобом обрабатывается спиртом и протирается стерильной салфеткой, производится соскоб быстрым скоблящим движением шпателя по слизистой щеки, которая перед этой процедурой протирается, при легком надавливании, ватным тампоном. Полученный материал переносится на предметное стекло и окрашивается одной каплей 1% ацетоорсеина (свежепрофильтрованного). Препарат накрывается покровным стеклом, сверху прикладывается слой фильтровальной бумаги. После этого производят умеренное надавливание покровного стекла большим пальцем руки в течение нескольких секунд. Остатки красителя удаляются. Нельзя допускать сдвигание покровного стекла при этой процедуре!

Изучение препарата производят в световом микроскопе с иммерсионной системой (х 1200— 1500), желательно с бинокулярной насадкой. На препарате половой хроматин должен быть обнаружен в виде тельца, окрашенного в темный цвет, размером около 1мкм и расположенного чаще всего под ядерной оболочкой (см. рис. 13.7).

Поскольку тельце Барра (половой хроматин) в норме определяется в ядрах в среднем у 30% клеток женщин, необходимо осуществить просмотр нескольких полей зрения в разных местах препарата и просчитать не менее 100 ядер. Необходимо учитывать только прилежащие к ядерной оболочке тельца полового хроматина.

Ацетоорсеин готовится по следующей методике: 1 г синтетического орсеина растворяется в 45 мл ледяной уксусной кислоты. Раствор доводится до кипения, охлаждается и фильтруется. К полученному раствору добавляются 55 частей дистиллированной воды. Производятся повторное кипячение, охлаждение и фильтрование.