Методы культивирования диссоциированных клеток гиппокампа

Подготовка мультиэлектродных матриц и покровных стекол

Перед посадкой первичных культур матрицы с электродами промывались в дистиллированной воде в течение 2 минут, а затем 2 часа выдерживались в 0,25% растворе трипсина (Gibco 25 200−056) для очистки от адгезированных на них нейрональных клеток после предыдущей посадки клеток. После этого мультиэлектродные матрицы стерилизовались в течение получаса под ультрафиолетом. Стерилизация покровных стекол проводилась в сухожаровом шкафу при температуре 140оС в течение 90 минут. Затем матрицы с электродами и стекла покрывались положительно заряженным гидрофильным веществом — полиэтиленимином (ПЭИ) (Sigma Р3143) для повышения адгезии клеток на их поверхность, после чего несколько раз промывались стерильной деионизированной водой.

Культивирование диссоциированных клеток гиппокампа

Эвтаназия беременной мыши на 18 день гестации (Е18) проводилась путем дислокации шейных позвонков. Матка с эмбрионами извлекалась из брюшной полости и помещалась в стерильную чашку Петри с раствором Хэнкса (Биолот X-12−05). Далее все процедуры выполнялись в стерильных условиях.

После промывания матки в растворе Хэнкса, производили извлечение эмбрионов. В результате хирургических манипуляций под бинокуляром извлекали головной мозг с последующим отделением гиппокампа из полушарий каждого из эмбрионов.

Выделенные гиппокампы подвергались механическому измельчению, затем суспензию помещали в 0,25% раствор трипсина на 20 минут с целью разрушения связей между клетками. Затем ткань несколько раз промывалась фосфатно-солевым буфером PBS (Gibco 70 011−051), суспензировалась в питательной среде, состоящая из 92,5% нейробазальной среды (NeurobasalTM (Invitrogen 21 103−049)), 5% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS (ПанЭко К055)), 2% биоактивной добавки B27 (Invitrogen 17 504−044), 0,5% глутамина (L-glutamin (Invitrogen 25 030−024)) и центрифугировалась в течение 1−2 мин при 1500 об/мин. Надосадочная жидкость удалялась, осадок подвергался ресуспензированию, после чего диссоциированные культуры были готовы к посадке. Суспензию клеток раскапывали по 30 мкл в центр матрицы или стекла, инкубировали в течение 2 часов для лучшего прикрепления клеток к субстрату, после чего в каждую культуру добавляли 1,5 мл питательной среды. Исходная плотность клеток составляла 9000 кл/мм2 согласно разработанному протоколу (Мухина И.В. и cоавт., 2009, Vedunova M.V. et al., 2013).

Поддержание жизнеспособности первичных культур гиппокампа

Жизнеспособность диссоциированных культур гиппокампа поддерживали в условиях СО2-инкубатора (MCO-18AIC, Sanyo) при температуре 35,5оС и газовой смеси, содержащей 5% СО2. На следующий день после посадки 30% культуральной среды заменялась на среду с меньшим содержанием сыворотки (94,5% Neurobasal, 4% B27, 1% L-glutamin, 0,5% FCS). В дальнейшем замена питательной среды проводилась по мере ее закисления в культуре (в среднем раз в 3 дня).