Влияние уровня малигнизации астроцитарных опухолей мозга человека на экспрессию коннексина-43

Щелевые контакты или gap junction формируются за счет семейства трансмембранных белков-коннексинов, обеспечивающих пассивный межклеточный обмен ионов и небольших молекул массой до 1 кДа [10]. Среди двадцати членов этого семейства особое значение в ЦНС и миокарде принадлежит коннексину-43 (Cx43) [25]. Показано, что во многих опухолевых клетках, например, в предстательной и молочной железе человека, наблюдается снижение экспрессии коннексина-43 [12,13,20,23]. При этом в качестве важного патогенетического механизма злокачественного опухолевого роста в настоящее время рассматривается нарушение межклеточных взаимодействий, реализуемых посредством щелевых контактов [5,14,22].

В доступной литературе существует не так много информации об изменении щелевых контактов при развитии астроцитарных опухолей головного мозга человека. Эти данные получены, преимущественно, в исследованиях, выполненных на культурах клеток, и отличаются противоречивостью [9,15,26]. Как известно, астроцитарные опухоли являются наиболее распространенным классом первичных нейроэпителиальных опухолей и составляют около половины всех опухолей головного мозга человека. По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), астроцитомы классифицируются на 4 уровня или Grade: Grade I (пилоцитарная или пилоидная астроцитома), Grade II (диффузная астроцитома: гемистацитарная, протоплазматическая, фибриллярная), Grade III (анапластическая астроцитома), Grade IV (мультиформная глиобластома).

В последнее время при исследовании астроцитарных новообразований широко используется метод иммуногистохимии, что подтверждается многочисленными исследованиями по различным аспектам данной проблемы [1,2,3,4,8,16,21]. Суть метода заключается в определении локализации антигенов в определенных компонентах тканей, типах клеток и клеточных структурах с помощью специфических антител [7].

В данной статье представлены результаты иммуногистохимического анализа экспрессии белка коннексина-43 на разных уровнях малигнизации астроцитарных опухолей мозга человека.

межклеточный патогенетический иммуногистохимия астроцитарный Для исследования было использовано 12 образцов астроцитарных опухолей головного мозга человека, отличающихся по гистологическим показаниям и уровню малигнизации, а именно, по 4 образца астроцитом Grade II, III и IV (глиобластома). Исследование операционного материала человека проводилось в соответствии с лицензией № ФС-61−01−2 139 от 9 сентября 2013 года. Образцы фиксировались в 10% забуференном формалине, далее на вибратоме Leica изготавливались фрагменты размером 100 мкм, которые после обезвоживания заливались в парафиновые блоки по общепринятой методике. Следующим этапом являлось приготовление 4 мкм срезов на ультрамикротоме Leica. После депарафинирования и дегидратации срезов проводилась тепловая демаскировка антигенов в цитратном буфере (Dako, Дания). Для иммуногистохимического исследования срезов использовалось первичное кроличье поликлональное антитело — rabbit polyclonal anti-Connexin 43 (Сх43) (кат. № 71−0700, Invitrogen, USA) и система визуализации Dako EnVision System + Peroxidase (AEC), Dako Германия. После проведения иммуногистохимической реакции ядра клеток докрашивались гематоксилином.

Срезы инкубировали с первичным антителом к коннексину-43 (anti-connexin 43, rabbit polyclonal, Invitrogen, USA). В качестве положительного контроля использовались образцы миокарда. Визуализация препаратов проводилась при помощи светооптического микроскопа Leica 2500 (Германия). Интенсивность окрашивания рассчитывалась по условной 4-бальной шкале, в которой 1 соответствовала отсутствию окрашивания, 2 — слабому, 3 — умеренному, а 4 — сильному окрашиванию.

Для определения связи экспрессии коннексина-43 с прогрессией астроцитарных опухолей мозга человека было проведено иммуногистохимическое исследование срезов астроцитом с использованием специфического антитела к коннексину 43. Все результаты (Таблица 1) рассчитывались по описанной выше 4-х бальной шкале.

Таблица 1 — экспрессия коннексина-43 на разных уровнях малигнизации астроцитарных опухолей мозга человека.

Проведенный нами положительный контроль подтвердил специфичность иммуногистохимической реакции с антителом Cx-43, поскольку была выявлена экспрессия данного белка на вставочных дисках кардиомиоцитов, что, согласно литературным данным [17,18], соответствует формированию щелевых контактов в ткани миокарда (рис.1).

Рисунок 1. Экспрессия коннексина-43 в срезе миокарда крысы (Ч400). Стрелками отмечены участки экспрессии Сх43 на вставочных дисках.

При изучении ткани мозга в большинстве случаев была выявлена слабая или отрицательная реакция с антителом anti-Cx-43. На гистологических препаратах астроцитомы Grade II среди многочисленных очагов некроза наблюдались несколько типов клеток различной величины: незрелые полиморфные нейроны в светлом окружении, ганглиозные клетки треугольной формы, расположенные группами и цепочками, клетки микроглии с мелкими ядрами, а также астроциты с небольшими цитоплазматическими телами. Также обнаруживались единичные группы, включающие две — три клетки.

При проведении иммуногистохимической реакции на диффузных астроцитомах Grade II в выборочных одиночных астроцитах визуализировалась выраженная реакция на коннексин-43 (рис. 2, стрелки), а также диффузная положительная реакция на некоторых участках опухоли.

Рисунок 2. Астроциты (стрелки), экспрессирующие коннексин-43 в астроцитарных опухолях мозга человека Grade II (Ч400).

После проведения иммуногистохимической реакции с антителом anti-Сх-43 на препаратах анаптической астроцитомы (Grade III) визуализировалось резкое уменьшение структурных элементов, содержащих данный антиген, наблюдалась характерная «зернистость» за счет гранул хромогена, идентифицирующих локализацию белковых компонентов в цитоплазме и отростках опухолевых клеток (рис.3).

Рисунок 3. Экспрессия коннексина-43 в анапластической астроцитоме мозга человека Grade III (Ч1000). Стрелками обозначены гранулы хромогена.

На гистологических препаратах мультиформной глиобластомы наблюдались веретенообразные клетки, формирующие тяжи и волокна с гиперхромными мелкими ядрами различной формы, большое количество митозов, в том числе, патологических. На фоне большого количества незрелых вытянутых ядер наблюдались крупные, даже гигантские полиморфные клетки с темными ядрами неправильной формы. Клетки формировали пласты, отмечались очаги некроза и кровоизлияний. После проведения иммуногистохимической реакции с использованием антитела anti-Cx-43 было выявлено отсутствие экспрессии белка коннексина-43 во всех образцах глиобластомы (рис.4).

Рисунок 4. Отсутствие экспрессии коннексина-43 в мультиформной глиобластоме мозга человека (Ч400).

Астроцитомы представляют собой гетерогенную группу опухолей нейроэпителиального происхождения и являются самыми частыми первичными опухолями головного мозга, составляя около 50% всех интракраниальных бластом [6,24]. Как правило, они подразделяются на 4 уровня, из которых астроцитома Grade I (пилоцитарная, или пилоидная, астроцитома) считается доброкачественной, но способной к дальнейшему перерождению. Астроцитома Grade II является опухолью с низким уровнем малигнизации, а Grade III — высокомалигнизированной опухолью, при развитии которой наблюдается высокая клеточная пролиферация, ядерная атипия и анаплазия. Самой агрессивной астроцитомой является мультиформная глиобластома (Grade IV), так как помимо изменений, характерных для астроцитомы Grade III, она приобретает способность к метастазированию. В настоящее время все более пристальное внимание уделяется исследованиям роли межклеточных взаимодействий в процессах злокачественной трансформации и механизмах противоопухолевой резистентности данной группы опухолей. Щелевые контакты занимают особое место среди различных типов межклеточных взаимодействий, поскольку являются ключевым структурно-функциональным фактором поддержания метаболического гомеостаза в нервной ткани. Нами наблюдалось снижение уровня экспрессии белка, формирующего щелевые контакты глиальных клеток мозга (коннексина-43), при повышении степени злокачественности астроцитарной опухоли. Это указывает на связь экспрессии коннексина-43 с прогрессией опухолевого роста, что было показано и в исследованиях других метастатических опухолей [11].

Дальнейшее изучение изменений щелевых контактов, как единственной структурной основы межклеточных взаимодействий в глиальных опухолях, а также их белков-коннексинов будет способствовать расширению существующих представлений о патогенезе злокачественного процесса, выявлению новых диагностических и прогностических показателей и разработке эффективных методов активизации противоопухолевых механизмов.

• 1. Коршунов А. Г., Сычёва Р. В. Иммуногистохимическое изучение экспрессии онкобелка p53 в астроцитарных глиомах больших полушарий головного мозга // Архив патологии. 1996. № 6. С. 37−42.
• 2. Коршунов А. Г., Сычева Р. В., Пронин И. Н. и др. Прогностическое значение иммуногистохимического выявления апопто-за и экспрессии белков лекарственной устойчивости в глиобластомах боль-ших полушарий головного мозга // Архив патологии. 2000. № 1. С. 7−11.
• 3. Коршунов А. Г., Сычева Р. В., Пронин И. Н. и др. Прогностическое значение онкоассоциированных белков и апоптоза в глиобластомах больших полушарий головного мозга // Вопросы нейрохирургии. 1999. № 1. С. 3−7.
• 4. Коршунов А. Г., Сычёва Р. В. Экспрессия глиального фибриллярного кислого белка и белка S-100 в астроцитарных глиомах головного мозга различной степени злокачественности (иммуногистохимическое исследование) // Архив патологии. 1995. № 4. С. 30−38.
• 5. Крутовских В. А. Роль межклеточных взаимодействий через щелевые контакты в канцерогенезе. Санкт-Петербург, 2005, 131 с.
• 6. Пальцев М. А., Аничков Н. М. Атлас патологии опухолей человека. М.: ОАО Издательство «Медицина», 2005. 424 с.
• 7. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей челове-ка / под ред. Петрова С. В., Райхлина Н. Т. 2-е изд., доп. и перераб. Казань. 2000. 288 с.
• 8. Юсубалиева Г. М., Баклаушев В. П., Гурина О. И. и др. Иммуногистохимический анализ глиофибриллярного кислого белка в оценке астроглиальной реакции при экспериментальной глиоме С6 // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2010. № 1. С. 17−22.
• 9. Badoual M., Deroulers C., Aubert M., et al. Modelling intercellular communication and its effects on tumour invasion // Physical biology. 2010. Vol. 7(4): 46 013. doi: 10.1088/1478−3975/7/4/46 013.
• 10. Beyer E.C. Gap junctions // International Review of Cytology-a Survey of Cell Biology. 1993. Vol. 137. C. 1−37.
• 11. Hirschi K.K., Xu C.E., Tsukamoto T., et al. Gap junction gene cx26 and cx43 individually suppress the cancer phenotype of human mammary carcinoma cells and restore differentiation potential // Cell Growth Differ. 1996. Vol. 7. P. 861−870.
• 12. Huang R-P., Hossain M.Z., Sehgal A., et al. Reduced Connexin43 Expression in High-Grade Human Brain Glioma Cells // Journal of Surgical Oncology. 1999. Vol. 70. P. 21−24.
• 13. Lee S-W, Paul D.L., Keyomarsi K., et al. Transcriptional downregulation of gap junction proteins blocks junctional communication in human mammary tumor cell lines // Journal of Cell Biology. 1992. Vol. 118. P. 1213−1221.
• 14. Naus C.C., Laird D.W. Implications and challenges of connexin connections to cancer // Nature reviews. Cancer. 2010. Vol. 10(6). P. 435−441.
• 15. Oliveira R., Christov Ch., Guillamo J.S., et al. Contribution of gap junctional communication between tumor cells and astroglia to the invasion of the brain parenchyma by human glioblastomas // BMC Cell Biology. 2005. Vol. 6:7. doi:10.1186/1471−2121−6-7.
• 16. Ranuncolo S.M., Varela M., Morandi A., et al. Prognostic Value of Mdm2, p53 and p16 in Patients with Astrocytomas // Journal of Neuro-Oncology. 2004. Vol. 68 (2). P. 113−121.
• 17. Severs N.J., Dupont E., Kaba R., et al. Gap junction and connexin remodeling in human heart disease. Gap junctions in development and disease // Springer-Velgar Berlin Heidelberg. 2005. P. 57−82.
• 18. Severs N.J. Intercellular junctions and the cardiac intercalated disk. In: Harris P., Poole-Wilson P.A. (eds) Advances in myocardiology. Plenum, New York, P. 223−242.
• 19. The 2007 WHO Classification of Tumors of the Central Nervous System / D. N. Louis et al. // Acta Neuropathol. 2007. Vol. 114. P. 97−109.
• 20. Tomasetto C., Neveu M.J., Daley J., et al. Specificity of gap junction communication among human mammary cells and connexin transfections in culture // Journal of Cell Biology. 1993. Vol. 122. P. 157−167.
• 21. Torp S.H. Diagnostic and prognostic role of Ki-67 immunostaining in human astrocytomas using four different antibodies // Clinical Neuropathology. 2002. Vol. 21 (6). P. 252−257.
• 22. Trosko J.E., Ruch R.J. Cell-cell communication in carcinogenesis // Frontiers in bioscience: a journal and virtual library. 1998. Vol. 15(3). P. 208−236.
• 23. Tsai H., Werber L., Davia M.O., et al. Reduced connexin43 expression in high grade, human prostatic adenocarcinoma cells // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1996. Vol. 227. P. 64−69.
• 24. Wen P.Y., Kesari S. Malignant gliomas in adults // New England Journal of Medicine. 2008. Vol. 359 (5). P. 492−507.
• 25. Yamasaki H., Naus CCG. Role of connexin genes in growth control // Carcinogenesis 1996. Vol. 17. P. 1199−1213.
• 26. Zhang W., Couldwell W.T., Simard M.F., et al. Glioma Cells and Astrocytes Direct Gap Junction Communication between Malignant // Cancer research. 1999. Vol. 59. P. 1994;2003.