Геномные библиотеки — источник зондов для FISH

Картирование уникальных генов и различных анонимных последовательностей ДНК на хромосомах человека было начато задолго до начала тотального секвенирования его генома и во многом послужило основой для его успешного проведения. С целью исследования генома человека были разработаны различные методики получения BAC-, YACбиблиотек геномных ДНК-последовательностей, позволившие секвенировать отдельные фрагменты генома и собирать из них фрагменты генома большего размера. Был разработан метод создания NotI-библиотек, специфичных для одной хромосомы и для генома в целом. Поскольку NotI сайты ассоциированы с генами, то исследование последовательностей ДНК из этих библиотек позволило обнаружить и картировать множество генов на хромосомах человека. Можно привести пример гена Harakiri (Рис. 10), вовлеченного в процесс апоптоза клеток.

Рис. 10. Локализация на 12 хромосоме человека (12q13.1) гена Harakiri (красный). Хромосомы окрашены DAPI (синий).

Кроме того, использование клонов ДНК из NotI-библиотек позволило уточнить последовательность расположения генов в некоторых районах хромосомы 3 человека и выявить новые предполагаемые гены-супрессоры опухолевого роста. Сконструированные на основе NotI клонов ДНК микрочипы позволили создать новую технологию сравнительного анализа геномной ДНК, выделенной из нормальных и опухолевых клеток, дающую возможность выявлять генетические и эпигенетические изменения в геномах клеток на разных стадиях канцерогенеза. Интенсивные исследования генома человека также положили начало развитию молекулярной цитогенетики растений. Методики, разработанные для изучения хромосом человека и животных, были модифицированы и широко применяются для исследования хромосомной организации геномов растений. Интенсивные исследования структуры геномов растений (в первую очередь арабидопсиса) обнаружили, что участки генов растений, также как и животных, обогащены CpG-последовательностями, содержат NotI сайты рестрикции, метилирование которых и у растений является одним из способов эпигенетической регуляции [Matsuyama et al., 2003]. Нами были проведены пилотные эксперименты по получению геномных NotI библиотек из Triticum aestivum L., L. usitatissimum и L. austriacum, используя методику создания NotI — связующих библиотек человека. Из генома пшеницы (около 7 млрд. п.н.) не было получено ни одного клона. В то же время с первой попытки из геномов льнов (около 650 млн. п.н. для L. usitstissimum) получен 41 клон геномных фрагментов. В результате сравнения сиквенсов этих последовательностей с имеющимися в базах данных (NCBI Blast и Arabidopsis thaliana WU-BLAST2) для 22 ДНК клонов не было обнаружено гомологий. Среди остальных выявлены гомологии с фрагментами хлоропластных и ядерных генов, а также с ДНК-последовательностью ретротранспозонного элемента, гомология с сиквенсом которого приведена на рис. 11.

Рис. 11. Гомология клона 32 из генома L. usitatissimum (сорт Оршанский 2) gypsy-подобному семейству ретротранспозонов (Athila).

Таким образом, наши результаты показали перспективность использования NotI-библиотек для исследования геномов небольшого размера у растений.