Структурно-функциональный анализ элонгационных комплексов бактериальной РНК полимеразы

ДНК-зависимые РНК полимеразы (РНКП), катализирующие синтез матричной РНК, являются ключевыми ферментами в экспрессии генетической информации у всех живых организмов. Среди ферментов этого класса выделяют односубъединичные РНКП бактериофагов и митохондрий и многосубъединичные РНКП хлоропластов, прокариотических и эукариотических организмов. Несмотря на отличие односубъединичных и многосубъединичных РНКП, особенно в структурной организации, они используют общий механизм катализа (нуклеофильное замещение), основанный на присутствии двух ионов Mg2+ в активном центре ферментадостигают практически полной процессивности в элонгационной фазе, формируя РНК-ДНК гибрид одинаковой длиныимеют сходство в механизмах биохимических процессов инициации, элонгации и терминации синтеза РНК. Наиболее охарактеризованной и изученной является односубъединичная РНКП бактериофага Т7 (Т7 РНКП). В силу некоторых общих закономерностей модели транскрипционных процессов, полученные для Т7 РНКП, могут быть рассмотрены для многосубъединичных РНКП.

Многосубъединичные РНКП ответственны за синтез практически всех клеточных РНК. Аминокислотные последовательности полипептидов многосубъединичных РНКП содержат большое число консервативных областей, а данные кристаллографических исследований демонстрируют сходство пространственной организации. Особенно высокая степень гомологии наблюдается в области активных центров, что отражает аналогичность их функционирования во всех многосубъединичных РНКП. Более простое строение бактериальных РНКП (6 субъединиц) по сравнению с эукариотическими, содержащими до 17 субъединиц (в случае РНКП III), делает первые прекрасной моделью для изученияклеточных РНКП в целом. Поскольку структура белка определяет его функцию, структурный анализ многосубъединичных РНКП, среди которых известны высокоразрешенные кристаллические структуры кор-фермента T. aquaticus [3], холофермента T. thermophilus [34], дрожжевой РНКП II и ее элонгационных комплексов (ЭК) [41, 92, 101, 117−120], а также комплексов РНКП с различными антибиотиками и транскрипционными факторами [103, 158, 159, 164, 198, 199], вместе с данными биохимических, биофизических и генетических исследований позволяют предположить возможные механизмы функционирования.

В процессе транскрипции выделяют три этапа: 1) инициацию, характеризующуюся связыванием РНКП с промотором, абортивным синтезом и началом образования РНК-транскрипта- 2) элонгацию, в ходе которой происходит формирование стабильного элонгационного комплекса (ЭК), в состав которого входят кор-фермент РНКП, молекула транскрибируемой ДНК, образующийся РНК-транскрипт, и процессивный синтез РНК- 3) терминацию, завершающую синтез РНК-транскрипта и приводящую к диссоциации ЭК. Взаимодействия РНКП с различными сигнальными последовательностями* нуклеиновых кислот и (или) вспомогательными транскрипционными факторами контролируют транскрипцию, регулируя экспресию генов. Синтез РНК осуществляется, главным образом, на этапе элонгации в результате многократно повторяемого цикла добавления нуклеотида, (ЦДН) — представленного последовательными стадиями: связывания субстрата NTP в активном центре РНКП, катализа — включения NMP в транскрипт и транслокации фермента, которые сопровождаются конформационными изменениями ЭК. При транслокации РНКП перемещается по транскрибируемой цепи молекулы ДНК, что позволяет рассматриватьпоступательное движение фермента как работу молекулярного мотора, функционирование которого основано либо на броуновском и собственном тепловом движении, либо на действии движущей силы, которая, в данном случае, может быть представлена реализацией энергии расщепления высокоэнергетической связи в молекуле субстрата NTP путем преобразования конформационного состояния РНКП (ЭК). Прямых доказательств, свидетельствующих в пользу той или иной причины транслокации, пока не получено. Кроме полимеразной активности для РНКП1 характерны способность к пирофосфоролизу — процессу, обратному образованию фосфодиэфирной связи, собственная 3'-5'-экзонуклеазная активность и, индуцируемая транскрипт-расщепляющими факторами, эндонуклеазная активность. Архитектура РНКП и наличие подвижных структурных элементов, определяющих способность фермента к конформационным изменениям, обеспечивают осуществление этих процессов. Вследствие отсутствия структурных данных для каждой из возможных конформаций ЭК, на основании имеющихся фактов функциональное значение структурных элементов можно пока только предположить, хотя роль некоторых из них была продемонстрирована с помощью биохимических экспериментов с использованием мутантных форм РНКП.

В свете современных представлений об элонгации остаются неясными детальный ход событий ЦДН, полная картина конформационных изменений, претерпеваемых ЭК, и их взаимосвязь с биохимическими процессами, природа сил, вызывающих транслокацию, а также то, каким образом корректный NTP узнается РНКП и доставляется в активный центр, как обеспечивается^ точность воспроизведения последовательности транскрибируемой ДНК в РНК-транскрипте, что является причиной ошибок, продуцируемых РНКП, и возможнали их корректировка. Многие из этих аспектов остаются неизученными или недостаточно изученными, прямые доказательства предполагаемых механизмов, как правило, отсутствуют, в связи с чем в литературе часто приводятся несколько альтернативных моделей одного и того же процесса. Таким образом, для получения исчерпывающей картины функционирования РНКП, необходимо детальное изучение каждого элементарного шага катализируемых ею реакций.

выводы.

1. С помощью РНК-ДНК скаффолдов получены элонгационные комплексы бактериальных РНКП в пост-транслокационном и в пре-транслокационном состояниях. Конформационное состояние элонгационнных комплексов определяется, главным образом, длиной ДНК-РНК гибрида.

2. При исследовании взаимодействий бактериальной РНКП с антибиотиком Stl выявлены мутации, определяющие устойчивость, либо чувствительность РНКП к Stlопределено, что ингибирование на стадии элонгации происходит вне зависимости от конформационного состояния ЭКStl предотвращает изомеризацию активного центра полимеразы в каталитически компетентную «закрытую» конформацию.

3. Установлено, что высокий уровень ошибочного включения нуклеотида, комплементарного п+1 основанию Т ДНК, обусловлен участком некомплементарности или отсутствием НТ ДНК в области активного центрапродемонстрировано «выпетливаиие» акцепторного нуклеотида n Т ДНК в ЭК, стабилизируемое n+1 NTP, следствием которого может являться генерация РНКП замены в образующемся транскрипте.

4. С помощью метода гашения флуоресценции показано, что бактериальная РНКП «плавит» единственную пару оснований ДНК-дуплекса в активном центре фермента, что опровергает известную модель одновременного связывания в главном канале нескольких субстратных NTP, взаимодействующих с основаниями «расплавленной» Т ДНК.

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ.

РНКП РНК полимераза.

Т7 РНКП РНК полимераза бактериофага Т7.

ЭК элонгационный комплекс.

ЦДН цикл добавления нуклеотида.

Т ДНК транскрибируемая цепь ДНК.

НТ ДНК нетранскрибируемая цепь ДНК п.н. пара нуклеотидов нт нуклеотид.

ДС двухцепочечный скаффолд, содержащий олигонуклеотиды: Т ДНК, НТ ДНК, РНК.

ОС одноцепочечный скаффолд, содержащий олигонуклеотиды:

ТДНК, РНК.

ЭК ДС элонгационный комплекс, собранный на основе двухцепочечного скаффолда.

ЭК ОС элонгационный комплекс, собранный на основе одноцепочечного скаффолда.

ТБ транскрипционный буфер пДНК плазмидная ДНК.

ПААГ полиакриламидный гель.

ДСН додецилсульфат натрия.

NTP нуклеозидтрифосфат.

PPi пирофосфат.

Stl стрептолидигин.

ВН P'-F-спираль (Bridge helix).

TL P'-G-петля (Trigger loop).

AMPcPP аденозин-а, Р-метилентрифосфат — негидролизуемый аналог ATP, неспособный образовывать фосфодиэфирную связь.

UMPcPP урацил-а, Р-метилентрифосфат — негидролизуемый аналог UTP, неспособный образовывать фосфодиэфирную связь.

GMPcPP гуанозин-а, р-метилентрифосфат — негидролизуемый аналог GTP, неспособный образовывать фосфодиэфирную связь.

Ср Ап пирролоцитозин, флуоресцентный аналог цитозина 2-аминопурин, флуоресцентный аналог аденозина скаффолд модельная матрица, представляющая собой комплекс отожженных синтетических олигонуклеотидов пробел" отсутствие нуклеотида остановленный" ЭК откатившийся" ЭК транскрипционныи комплекс, полученный при инициации транскрипции с промотора результате остановки реакций полимеризации, осуществляемых РНКП, из-за отсутствия соответствующего NTP элонгационный комплекс (backtracked), образовавшийся в результате перемещения каталитического центра РНКП («откатывания» РНКП) на одну из внутренних фосфодиэфирных связей РНК-транскрипта.