Антибактериальное действие липосом и возможность их применения для профилактики раневой инфекции

Содержание

• — 107-ВЫВОДЫ

1. Суспензия фосфатидилхолин-холестериновых липосом обладает прямым бактерицидным действием по отношению ко всем исследованным условно патогенным и патогенным микроорганизмам в дозах 1.5−3.2 мг/ мл и выше. Чувствительность к действию препарата убывает в ряду: Salmonella entiriditis, Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonos aeruginosa и Escherichia coli.

2. Бактерицидная активность препарата определяется не только его молекулярным составом, но и обусловлена наличием везикулярной структуры используемых липидов, при отсутствии которой эффективность препарата снижается в 4 — 16 раз.

3. Бактерицидная активность липосомальной суспензии зависит от ее рН и содержания продуктов ПОЛ. Оптимальными параметрами липосомальной суспензии являются рН 4.8±0.12, уровень Щк 51.70±2.34 нмоль /мл — 75. 75±7. 03 нмоль/мл. При этих условиях МПК препарата составляет для Staphylococcus aureus -0.8 мг/мл, для Pseudomonos aeruginosa — 1.6 мг/мл.

4. Суспензия липосом в концентрациях в 125 — 250 раз ниже ин-гибиторных обладает антиадгезивным действием по отношению к эукари-отическим клеткам.

5. Введение суспензии фосфатидилхолин-холестериновых липосом с заданными параметрами подкожно животным дистальнее огнестрельной раны в дозе 25 мг/мл/кг приводит к снижению уровня обсемененности раны и инвазивноети бактерий вглубь тканей раневого канала.

Автор благодарит научных руководителей работы Заслуженного деятеля науки РСФСР, профессора Е М. Мельникову и Заслуженного деятеля науки РСФСР, профессора Т. И. Щраера, выражает искреннюю благодарность за творческую помощь д. м. н. В. М. Крейнееу, а также Н. Т. Лагунову, Я М. Марголина, И. М. Устьянцеву, R Г. Булгакова и Е. М. Еропкину за большую техническую помощь при подготовке материалов диссертации.

— 96 -ЗАКЛЮЧЕНИЕ Одним из перспективных направлений в современной медицине является использование липосомальной формы лекарственных препаратов и самих липосом для лечения целого ряда заболеваний (А. В. Стефанов с соавт., 1980, 1984- М. А. Владимирский с соавт., 1981- В. IL Торчилин с соавт., 1982- G. Gregoriadis, 1973 и др.). Выявленный авторами терапевтический эффект липосом основан на их способности встраиваться в цитоплазматическуго мембрану эукариотических клеток или обмениваться с ними лйпиднымй компонентами. Можно предположить, что подобный эффект может проявляться и при взаимодействии липосом с бактериальными клетками. Однако наличие на поверхности бактерий клеточной стенки является препятствием для непосредственного контакта между липосомальной и цитоплавматической мембранами. Поэтому вопрос о том. оказывают ли липосомы на бактериальную клетку столь же положительный эффект вследствие модификации клеточной мембраны оставался нерешенным, Тем не менее отсутствие непосредственного контакта между липосомальной и бактериальной цитоплавматической мембранами не исключает возможности воздействия липосом на другие поверхностные структуры бактерий. Кроме того, влияние на функциональную активность бактериальной клетки могут оказывать продукты биодеградации липосомальных липидов. В связи с этим изучение возможности влияния липосомальной суспензии на жизнеспособность бактериальной клетки может иметь как научный интерес, так и значимость для практического здравоохранения. Решение этих вопросов к явилось предметом нашего исследования.

Проведенные исследования впервые позволили установить, что пустые липосомы из фосфатидилхолина и холестерина в молярном соотношении 7: 5 обладают прямым бактерицидным действием на культуры условно патогенных и патогенных микроорганизмов. При этом степень чувствительности бактерий к действию препарата зависит от их видо nn> «

О I вой принадлежат Б результате проведенных исследований была определена минимальная подавляющая концентрация липосом для изучаемых штаммов бактерий, которая черев 24 часа инкубации составила для Pseudoronos aeruginosa и Escherichia ooli — 6.2 мг/мл, для Staphylococcus aureus и Proteus mirabilis — 3.1 мг/мл и для SaliTionella enter! tidis — 1. 5 мг/мл. Продление сроков инкубации до 48 и 72 часов позволило еще более снизить ингибирувдие концентрации препарата. Таким образом, выраженность зарегистрированного бактерицидного эффекта липосом находится в прямой зависимости от дозы использованного препарата и времени его воздействия на микроорганизмы. Присутствие: в среде инкубации компонентов биологических жидкостей снижает активность суспензии липосом, которая сохраняется для S. aureus при увеличении концентрации до 6.2 мг/мл, для гра-мотрицательных палочек — до 25.0 мг/мл и времени инкубации до двух суток. Снижение бактерицидной активности липосом может явиться и-ледст] дуктах их деградации (G. Weismann et all., 1977- D. Hoekstra, G. Scherphof, 1979), что приводит к увеличению проницаемости липосом, и, вследствие этого, их разрушению (Т. М. Allen, 1981). i с&п. гиЬгП. «иЛиииитЕ» ии^ДЬ ± aojaisj± uuuwja wtdwtfariwe i-, ± у у гьж g ynUs* Uwpc& зование, выявленная способность липосом подавлять рост бактерий может быть обусловлена как свойствами их структурных компонентов, так и упорядоченной структурой липидных молекул в составе липосомальной мембраны. Поэтому для решения вопроса о механизме антибактериального действия липосом важным этапом явилось определение влияния на этот процесс структурной организации микровезикул. Для этого изучали влияние на жизнеспособность бактериальной клетки исходных ингредиентов липосом в нелипосомальной форме. В результате проведенной работы выявлено, что в генезе бактерицидного действия отготт-твием сорбции везикул на белковых компонентах плазмы и про no su липосом существенное значение принадлежит упорядоченной бислойной структуре липосомальных везикул, так как использование липидов того ш состава в мицеллярной форме бактерицидного эффекта на исследуемые культуры практически не оказывает. Таким образом, проведенные исследования показали, что суспензия липосом может быть использована для подавления роста микроорганизмов.

Известно, что активность, многих веществ, в том числе и лекарственных, в большой степени зависит от физико-химических характеристик как самого препарата, так и условий внешней среды. В связи с этим для эффективного воздействия липосом на жизнедеятельность бактериальной клетки важным вопросом явилось изучение параметров, влияющих на бактерицидную активность липосом, и определение их оптимальных значений. Данные литературы свидетельствуют о зависимости физико-химических свойств липосомальной суспензии от величины рН (A. JL Клибанов с соавт., 1990- S. Tftoml inson et al., 1989) и содержания в ней продуктов ПОЛ (КХ А. Владимиров, 1989- 0. Cantoni et al., 1989- Th. A. Dahl et al. Д989- M. A. Nesmeyanova, XL V. Bogdanov, 1989). Поэтому для решения вопроса о возможности использования липосом в качестве антибактериального средства важной задачей явилось изучение и оптимизация этих показателей в липосомальной суспензии, а также стандартизация получаемых липосом по величине рН и уровню липидной пероксидации.

В результате проведенных исследований установлено, что антибактериальная активность суспензии липосом имеет обратную зависимость от ее рЕ При этом чувствительность культуры Ps. aeruginosa к действию препарата уменьшается с увеличением рН, и при значениях рН < 6 антибактериальный эффект липосом не проявляется. Для культуры S. aureus эффект отмечен при всех исследуемых значениях рН, хотя в кислой среде бактерицидная активность липосом проявляется на более раннних сроках. Такие различия в активности липосомальной суспензии по отношению к представителям грамположительной и грамот рицательной флоры могут быть связаны с характером строения их клеточной стенки. В случае грамположительных бактерий непосредственный контакт липосомальной и цитоплазматической мембраны невозможен из-за наличия клеточной стенки, и воздействие липосом на клетку может носить лишь опосредованный характер, осуществляясь либо за счет сорбции липосом на поверхностных структурах бактериальной клетки (В. И. Карамушка с соавт., 1987), либо за счет обмена отдельными липидными компонентами (L. I. Barsukov et al., 1976), либо пп пттагп n^TmtjTjrrr тАтя"пт"тттттпг гтплтгггт^тлг" Лгттглт? п*эт?пттг*г* wrmnnAim ттх. гттгчг ОС% ЬЧС1 JоЛжШПМШ, А иXIЧп?3iA rbXSJG SJlfLUMtbl родеЩШгх ^шии^ишсушдЫА липидов СЮ. А. Владимиров, А. И. Арчаков, 1972).

При взаимодействии липосом с грамотрицательными бактериями по мимо перечисленных механизмов может происходить непосредственное слияние липосом с внешней мембраной бактериальной клетки (S. Thomlinson et al., 1989). В этом случае липосомы, за счет модификации липидного бислоя мембран, могут выполнять свою защитную функцию, и на некоторое время предохранять бактериальную клетку от разрушения, с чем, вероятно, и связаны более длительные сроки гибели Ps. aeruginosa под действием липосомальной суспензии с кислыми значениями рН. Так как процесс слияния липосомальной и клеточной мембран наиболее активно осуществляется при нейтральных значениях рН (S. Thomlinson et al., 1989), этим можно объяснить тот факт, что при рН > 6 липосомы бактерицидного влияния на клетки грамотрица-тельных бактерий не оказывают. Кроме того, при рН ≥ 8 происходит увеличение количества бактерий в суспензии, что может быть связано с расищплением липосомальных липидов бактериальными ферментами (фосфолипаза С, щелочная фосфатаеа и др.} (А. Ф. Мороз, 1988) с последующим использованием продуктов их деградации в качестве: источ

— 100 кика питании.

Как известно, в присутствии кислорода фосфолипидные компоненты искусственных и биологических мембран подвержены процессу перекис ного окисления (Ю. А. Владимиров, А, И. Арчаков, 1972}, в результате чего происходит деформация мембранного лнпопротеинового комплекса, il4J. D ЕИШСЮ -L ИриАмЦоЬшии JL JJ WIOIWUpOJl ЦМЛ WpVjiUnUXS вида", иУДСкЙЛЯС: iUJl активность мембраносвязакных ферментов, нарушается целостность мембранного бислоя, что в итоге приводит к цитолизу и гибели клетки. В связи с этим, функциональная активность бактериальных клеток во многом определяется содержанием в их мембране и во внешней среде первичных и вторичных продуктов ИОД (Г, Готтшалк, 1982- 0. Cantoni et al., 1989- Th. A. Dahl, 1989). Поэтому воздействие на бактериальную клетку продуктов пероксидации липосомальных липидов может оказать значительное влияние на жизнеспособность бактериальной клетки.

В результате проведенных исследований показано, что в процессе инкубации как липосомальной, так и липосомально-бактериальных суспензий происходит накопление в них продуктов перекиеного окисления липидов. При этом содержание ЩА в них к концу периода наблюдения увеличивается прямопрспорционально значению рН липосомальной суспензии. Таким образом, б результате совместной инкубации wetn,±opjujri >ШгшиЬимсышпи1а и^ип^линш na, n. uiuicnjric- хз srmrvj бационной среде продуктов ПОЛ и гибель бактериальных клеток. Доказательством тому, что накопление продуктов липидной пероксидации играет существенную роль в механизмах 'гибели бактерий, явились результаты эксперимента, в котором для инкубации с бактериями использовали липосомы различной степени окисленности. В работе впервые показано, что содержание продуктов ПОЛ в липосомальной суспензии оказывает существенное влияние на выраженность бактерицидного действия липосом. В то же время, этот эффект не косит прянепропорциональной зависимости. Так, повышение уровня ЩА липосо-мальных суспензий с 31.53±3.12 нмоль/мл до 42.17 ±3. 86 нмоль/мл не вносит достоверных изменений в характер роста бактериальных культур, и лишь высокая степень окисленности суспензии (67.75 ±5.18 нмоль/мл и более) вызывает выраженное увеличение антибактериальной активности липосом.

Как и при воздействии кислых продуктов среды, влияние продуктов ПОЛ на жизнеспособность бактериальной клетки оказалось более выраженным по отношению к грамотрицательным бактериям. Вероятно, большая устойчивость культуры Ps. aeruginosa к используемым липосо-мам по сравнению с S. aureus связана с различной активностью у этих культур ферментативных систем, как принимающих участие в метаболизме перекисей липидов {цитохромы, каталаза, глутатионпероксидач, m тг1 тх тхгтптх&7хг*пгтчггггг «чтгмтг ттгкптталл i шг-,-л:-Ь/~ч т-iг тт г-lтл.^.тг-Т'П'г~,-Т*Cf — oaf, хan, mi пах пипууаяЩгих oiui имУЦсии i. xurbi-'yfcMWJi, aA-mjyUiuriUoem лйъ лота, глутатион, НАДФ) {Г. Готтшалк, 1982- С. Н. Голиков с соавт., 1986). Поскольку у клеток Ps. aeruginosa система антиоксидантной защиты, противодействующая развитию свободнорадикаяьного окисления, развита в большей степени, это позволяет ей более активно противодействовать токсическому воздействию продуктов ПОЛ.

Выявленные различия антибактериальной активности липосом по отношению к различным группам бактерий в зависимости от величины рН и уровня продуктов ПОЛ могут позволить конструировать липосомы с заранее заданными свойствами. Благодаря изменению в суспензии липосом этих параметров появляется возможность моноспецифического антибактериального воздействия на определенные группы микроорганизмов.

Таким образом, в результате проведенных исследований было установлено, что гибель бактериальных клеток наступает вследствие токсического воздействия на них продуктов липидной пероксидации.

Наиболее активно этот процесс происходит в кислой среде. Установлены оптимальные параметры липосомальной суспензии, при которых ее воздействие на различные типы бактериальных клеток наиболее выражено: рН 4. 8±0.12, ЦДЛ 51. 7G±75. 75 нмоль/мл.

Помимо воздействия на бактерии продуктов деградации липосо-мальных^липидов, липосомально-бактериальные взаимодействия могут осуществляться вследствие сорбции везикул на поверхностных структурах бактериальной клетки (ВЛ1 Карамушка с соавт, 1987- L. I. Barsukov et al., 1976). Такое взаимодействие может привести к изменению свойств бактериальной клетки, обусловленных активностью этих структур, в том числе оказать влияние на механизм адгезии бактерий к клеткам макроорганизма, активность которого определяется многими специфическими функциями клеточной поверхности {Д. Г. Звягинцев, а С, Гузев, 1971- А. Ф. Перцовская, 1971}. Изучение изменений адгезивной способности бактериальных клеток под действием липосом проводилось нами in vitro на примере адгезии S. aureus и Ps. aeruginosa к монослоям эукариотических клеток линий НЕр-2, HeLa и иммортализованным аетроцитам спинного ганглия. Проведенные исследования впервые показали, что суспензия липосом в ингибитор-ных и субингибиторных концентрациях обладает антиадгезивным действием, что проявляется в снижении уровня сорбции бактерий на поверхности эукариотических клеток на 28.2 — 79.8Z по сравнению с контрольными суспензиями. Полученные данные показали, что антиадгезивное действие липосом носит неспецифический характер как по отношению к бактериальным культурам, так и к различным линиям эукариотических клеток. Вероятно, снижение сорбционной активности бактериальных клеток происходит благодаря создаваемому липосомами механическому барьеру между адгезинами бактериальной и рецепторами эукариотической клеток, так как липосомы могут сорбироваться на

— 103 поверхностных образованиях как про-, так и эукариот (JL Б. Марголис, Л. Д. Бергельсон, 1986- А. С. Allison, P. David, 1975).

Проведенные in vitro исследования позволили предположить, что л*ттглтгптт Ann^nrnwirrj-TrwA mm-vn т^птлттлтз? w ттлпАи л «пттттт тггт/г Аиптж» u^Uiicncj&n. фиицга & лОлс w I fepyinuiDoui.^шниииж и о саДсах1П? ЭШ1*1 ко -химическими параметрами может быть использована в качестве лекарственного препарата для лечения инфекционных заболеваний, вызванных условно патогенной флорой. Возможность практического использования липосом в качестве антибактериального средства предполагает подтвеждение зарегистрированных in vitro бактерицидного и антиадгезивного аффектов препарата при введении его в организм, поскольку взаимодействие липосом с биологически активными компонентами крови и тканей может значительно изменить их свойства (G. Weismann et all., 1977- Т. М. Allen, 1981) и нивелировать эффект, зарегистрированный в опытах in vitro.

Исследования in vivo были проведены на кроликах с моделью огнестрельной раны мягких тканей бедра. Помимо оценки общей микробной обсемененности тканей раневого канала и выявления качественного состава раневой микрофлоры была проведена топографическая оценка распространенности микроорганизмов в мягких тканях к периферии от раневого канала. Эксперименты на животных подтвердили высокую антибактериальную активность исследуемого препарата. На протяжении всего периода наблюдения (первая и вторая фазы раневого процесса) обсемененность всех исследуемых тканей к периферии от раневого канала у животных, которым в течение 1 часа после нанесения травмы была введена. суспензия липосом, была достоверно ниже, чем у животных контрольной группы. При этом если у животных контрольной группы обсемененность всех исследованных тканей Ьгнест-рельной раны превысила критический уровень уже через 1 сутки после травмы, то у животных опытной группы микробная обсемененность дос

— 104 тигала критического уровня только на 3 сутки после травмы (в период максимального развития воспалительного процесса) и только в тканях, непосредственно прилежащих к раневому каналу. Антибактериальное действие суспензии липосом проявлялось не только в уменьшении уровня обсемененности тканей огнестрельной раны, но и в снижении уровня инвазивности бактерий вглубь тканей. По сравнению с контрольной группой животных, количество бактерий в тканях, расположенных на различном расстоянии от раневого канала, у животных опытной группы было на 48.3−79.3% ниже. Хотя препарат животным вводили однократно, эффективность его действия сохранялась на протяжении всего периода наблюдения. Некоторое увеличение численности бактерий на 9 сутки у животных опытной группы, вероятно, связано с тем, что к этому сроку содержание препарата в тканях значительно снижается, так как период полувыведения липосом из тканевого депо составляет 4 — 6 суток (Т. И. Щраер с соавт., 1988).

Существенные отличия между животными обеих групп отмечены при анализе качественного состава раневой микрофлоры. Исследования показали, что состав микрофлоры ран у животных контрольной группы был более разнообразным, чем у животных опытной. Из ран животных контрольной группы преимущественно высевались ассоциации из 2−3 видов бактерий, в то время как в опытной группе в 30% высевались монокультуры. Кроме того, если общее число выделенных штаммов у контрольных животных достигало 8−8, то у животных опытной группы оно не превышало 2−5. При этом если из ран контрольных животных преимущественно высевались условно патогенные бактерии СS. aureus и представители кишечной группы.), то у опытных животных помимо S. aureus доминировали Micrococcus sp. и грамотрицательные нефер-ментирующие палочки. В процессе наблюдения отмечались изменения состава раневой микрофлоры. Если в начальный период из ран живот

— 105 ных обеих групп преимущественно высевались кожи, то начиная с 6 суток в ранах животных контрольной группы начала превалировать палочковая группа бактерий при доминирующей роли представителей кишечной флоры, Это согласуется с данными, полученными при изучении посттравматической инфекции у людей (А. М, Королюк с соавт., 1989). У животных опытной группы изменение микробного пейзажа произошло на 3 суток позже (9 сутки) и было менее выражено. Вероятно, это связано с тем, что у этой группы животных процесс очищения раны от раневой микрофлоры осуществлялся более активно, чем у контрольных животных. Вследствие этого более интенсивно происходило заселение ран микрофлорой вивария.

Эксперименты на животных с моделью огнестрельной травмы мягких тканей подтвердили наличие выявленного в экспериментах in vitro антибактериального действия пустых фосфатидилхолин-холестериновых липосом. Использованный препарат после однократного подкожного введения оказывал выраженный антибактериальный эффект, который проявлялся как в снижении численности бактерий, контаминируюшях ткани раны, так и в уменьшении их распространенности к периферии от раневого канала. Полученный эффект может быть обусловлен показанными in vitro бактерицидным и антиадгезивным действием липосом. Кроме того, существенное улучшение клинической картины инфекционного процесса у животных опытной группы могло быть обусловлено сорбцией на липосомальных мембранах целого ряда микробных токсинов (W. В. Van Heyningent1971), а также продуктов эндогенной интоксикации (А. В. Стефанов с соавт., 1984).

Таким образом, проведенные исследования показали, что однократное подкожное введение суспензии фосфатидилхолин-холестериновых липосом с заданными физико-химическими параметрами может быть использовано для профилактики раннего нагноения микробно загрязнен

— 106 яых ран. Для подтверждения эффективности препарата у больных с микробно загрязненными ранами необходимо дальнейшие его клинические изучение, что является задачей нашего дальнейшего исследования. С этой целью данные о специфическом действии препарата и его токсикологические характеристики представлены в Фармакологический комитет и получено разрешение на проведение первой фазы его клинических испытаний.