Оптимизация технологии получения препаратов-пробиотиков

Актуальность проблемы Одним из достижений конца XX века явились разработка и внедрение в жизнь концепции «пробиотики и функциональное питание» [Шендеров Б.А., 2002; Roberfroid М.В., 1998; Kenings W.N., 2000]. Практическая реализация данной концепции способствует решению проблемы массового оздоровления населения, так как реальные и потенциальные потребности отечественного рынка пробиотиков обусловлены широкой распространенностью нарушений естественного микробиоценоза человека.

Приоритетным направлением современной промышленной микробиологии являются многоплановые исследования в области разработки эффективных средств коррекции биоценозов, усовершенствовании выпускаемых форм препаратов, интенсификации и повышении экономической эффективности производства [Алешкин В.А., 2002; Поспелова В. В. и др., 2002; Бонда-ренко В.М. и др., 2004; Collins M.D., Gibson G.R., 1999; Cummings J.H. et’al., 2001; Floch M.N., Hong — Curtiss J., 2001].

Прогноз, основанный на анализе экономических и технологических тенденций в сфере производства отечественных пробиотиков, позволяет сделать вывод о том, что в условиях ограниченных инвестиционных возможностей минимизация затрат, необходимая для развития производства в соответствии с требованиями GMP, может быть достигнута лишь при повышении эффективности технологических процессов [Казьянин А.В. и др., 2002]. Одним из стратегических направлений развития индустрии препаратов и продуктов функционального питания с пробиотическими свойствами является усовершенствование методологии промышленного получения биомасс кислотообразующих микрооргаиизмов-пробионтов, в частности, требуют дальнейшего разрешения вопросы обоснования и регламентации характеристик питательных сред для крупномасштабного культивирования лактои бифидобактерий [Лазарева Г. И., 1991; Критская И. В. и др., 1996; Андреева М. А. и др., 1998;.

Степаненко П.П., 1999; Ганина В. И., 2001; Тихомирова Н. А., 2001; Poch Mi, Bezkorovainy А., 1988; Gibson G.R., Fuller R., 2000]. ' :

Известно, что потребность микроорганизмов в питательных веществах является фенотипическим выражением их генома. Формирование чрезвычайно ограниченных синтетических способностей лактои бифидобактерий филогенетически обусловлено их обитанием в естественных нишах биоценоза, где нутриенты значительно гидролизованы пищеварительными ферментами макроорганизма [Бойцов А.Г. и др., 1990; Работнова И. Л, Позмогова И. Н., 1993; Степаненко ПЛ.,. 1999]. При изучении питательных потребностей лактои бифидобактерий, адаптировавшихся к комплексным органическим субстратам, выявлена необходимость наличия в составе питательных сред аминокислот, витаминов, пуриновых и пиримидиновых оснований, аминосаха-ров и других ингредиентов, к примеру, известно, что молочнокислые бактерии неизменно нуждаются в витаминах группы Вив значительном количестве аминокислот, потребности в которых гораздо шире соответствующих потребностей высших животных [Stanier R. Y., 1979]. Но, в то же время, анач лиз литературы не позволяет сделать достоверные выводы о влиянии амйно-кислотно-пептидного состава ферментативных белковых гидролизатов на накопление биомасс лактои бифидобактерий вследствие разноречивости данных о наиболее пригодных для них формах азотистого питания [Рахимова Н.Г., 1969; Воронкина И. М., 1970; Эрвольдер Т. М. и др., 1980; Назарова А. А., 1991; Работнова И. Л, 1993; Андреева М. А., 1998; Степаненко ПЛ., 1999; Stanier R.Y. et al, 1979; Jeremija L. et al., 1983; De Feo J.A., 1985]. Регламентированные технологии производства питательных сред для культивирования лактои бифидобактерий предусматривают использование гидролизата казеина с высокой степенью конверсии белка после гидролиза в течение 5−7 .суток [Рахимова Н.Г. и др., 1975].

Исходя из этого, одним из актуальных направлений создания препаратов и продуктов функционального питания с пробиотическими свойствами Являются разработка методов направленного гидролиза биологического сырья для получения белковых гидролизатов и дрожжевых автолизатов с заданными свойствами, в частности, с увеличенным содержанием фракций, обладающих ростстимулирующим действием на изучаемые культуры микроорганизмов, и конструирование на их основе питательных сред с высокими ростовыми свойствами для накопления биомасс лактои бифидобактерий [Тер-новская JI.H. и др., 1993; Критская И. В. и др., 1996; Ильина P.M. и др., 2000; ГанинаВ.И., 2001; D. Dai, W.A.Walcer, 1999].

Цель исследования: разработка питательных сред, обеспечивающих высокую скорость роста и стабильность основных биологических свойств производственных штаммов лактои бифидобактерий. 3— ;

Задачи исследования:

1 Оптимизировать промышленные способы получения основных компонентов питательных сред — ферментативных белковых гидролизатов’и дрожжевых автолизатов.

2 Изучить влияние степени конверсии субстратов, качественных и кбли-чественных характеристик аминокислотного состава ферментативных белковых гидролизатов на скорость роста и стабильность основных биологических свойств производственных штаммов лактои бифидобактерий. «- -'.

3 Сконструировать питательные среды с высокой ростстимулирующей активностью для культивирования лактои бифидобактерий.

4 Охарактеризовать производственные штаммы лактои бифидо-бактерий по совокупности биологических свойств: антагонистической'-'-ки-слотопродуцирующей, адгезивной активности, антибиотикорезистентности, устойчивости к биологическим жидкостям желудочно-кишечного тракта: ¦ «.

5 Изучить скорость роста и стабильность основных биологических свойств подобранных производственных штаммов лактои бифидобактерий в сконструированных питательных средах. ««.

Научная новизна.

Впервые выявлено ростстимулирующее действие фракций белковых гидролизатов с различной степенью конверсии белка на накопление биомасс лактои бифидобактерий. На основании изучения потребностей микроорганизмов в наиболее усвояемых формах азотистого питания оптимизированы условия гидролиза подобранных многосубстратных белковых основ, обеспечивающие эффективные кинетические параметры процесса и максимальный выход продукта с заданными степенью конверсии белка и аминокислотным составом.

Предложена двухстадийная модель биотрансформации дрожжевого сырья с последовательной активацией ферментативного профиля автолизи-рующих дрожжей, обеспечивающая получение ферментативного гидролизата с высоким содержанием аминокислот, производных нуклеиновых кислот’и витаминов группы В. .

Новизна проведенных исследований подтверждена решением № 2 002 132 307 о выдаче патента на изобретение «Способ получения панкреатического белкового гидролизата и питательная среда для культивирования бифидобактерий с его использованием» от 26.11.2004 г.

Научно-практическая значимость работы.

1 Оптимизированы промышленные способы производства ферментативных белковых гидролизатов с дифференцированными для лактои бифидобактерий степенью конверсии белка и аминокислотным составом. «¦г :

2 Разработан способ реакторного получения ферментативного дрожжевого гидролизата с индуцированными условиями ведения процесса, последовательной активацией эндогенных и экзогенных ферментов, обеспечивающий получение продукта с высокой ростстимулирующей активностью в: Отношении лактои бифидобактерий.

3 Сконструированы рецептуры питательных сред для культивирования производственных штаммов лактои бифидобактерий, обеспечивающие 'высокую скорость роста и стабильность основных биологических свойств''бактериальных популяций. f.

4 Дана сравнительная характеристика производственных штаммов лактои бифидобактерий, используемых в иммунобиологической и молочной.

•¦У-'' промышленности, по совокупности биологических свойств, определяющих расширение спектра традиционных регламентированных требований: антагонистической, кислотопродуцирующей, адгезивной активности, антибиоти-корезистентности, устойчивости к биологическим жидкостям желудочно-кишечного тракта.

5 Изучены скорость роста и стабильность основных биологических свойств бактериальных популяций подобранных штаммов лактои бифидобактерий, полученных в новых питательных средах.

Внедрение результатов исследования в практику.

По материалам исследований составлена и утверждена нормативно-техническая документация:

1. Регламент производства № 1195−02 Лактобактерии сухой.

2. Регламент производства № 1165−02 Бифидумбактерин сухой Основные положения, выносимые на защиту.

1 Ростстимулирующее действие на накопление биомасс лактои бифидобактерий оказывает степень конверсии белковых субстратов. Максимальный ростстимулирующий эффект на штаммы лактобактерий оказывают гид-ролизаты с глубокой степенью конверсии белка, содержащие (0,85±0,05) % аминного азота, на штаммы бифидобактерий — гидролизаты со среднейстепенью конверсии белка, содержащие (0,425±0,025) % аминного азота.

2 Оптимизированные способы направленного гидролиза многосубстратных белковых основ обеспечивают эффективные кинетические параметры процесса и максимальный выход продукта с заданными степенью конверсии белка и аминокислотным составом.

3 Разработанная двухстадийная модель биотрансформации’Дрожжевого сырья с индуцированными условиями автолиза и последовательной активацией ферментативного профиля дрожжей обеспечивает максимальный выход ферментативного дрожжевого гидролизата с высоким содержанием аминокислот, производных нуклеиновых кислот и витаминов группы В.

4 Сконструированные питательные среды обеспечивают высокую скорость роста и стабильность основных биологических свойств производственных штаммов лактои бифидобактерий.

5 Бактериальные популяции производственно-ценных штаммов L. plantarum 8Р-АЗ, L. fermentum 90Т-С4, В. bifidum 1 и В. adolescentis МС-42, полученные в новых питательных средах, обладают высокой специфической активностью и стабильностью основных биологических свойств.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», посвященной 95-летию Уфимского НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова ГУП «Иммунопрепарат» (Уфа, 2000), Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004), Международном научно-практическом семинаре «Вопросы вакцинопрофилактики и иммунокор-рекции» (г. Ташкент, 2004), заседании Ученого совета Уфимского НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и CP РФ «Иммунопрепарат» (протокол № 4 от 24.11.2004 г.).. 1.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, получено положительное решение № 2 002 132 307 о выдаче патента на изобретение (2004 г.).

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 185 страницах, иллюстрирована 40 таблицами, 16 рисунками и 4 технологическими схемами производства. Работа состоит из введения, обзора лите Выводы.

1 Установлена оптимальная для микроорганизмов родов Lactobacte-rium и Bifidobacterium степень конверсии белковых субстратов, оказывающая ростстимулирующее действие на накопление биомасс. Максимальный ростстимулирующий эффект на штаммы лактобактерий оказывают гидролизаты с глубокой степенью конверсии белка, содержащие (0,85±0,05) % аминного азота, 65−70% незаменимых аминокислот, на штаммы бифидобактерий — гидролизаты со средней степенью конверсии белка, содержащие (0,425±0,025) % аминного азота, 74−78% незаменимых аминокислот.

2 Оптимизированы промышленные способы производства панкреатических белковых гидролизатов из субстратов биологического происхождения, обеспечивающие получение продукта с заданной степенью конверсии.

Примененная двухстадийная модель гидролиза многосубстратных белковых основ увеличивает степень конверсии белка на 25−35%, выход свободных аминокислот — на 35 -105%, способствует ускорению кинетических параметров процесса: сокращает продолжительность в 5 раз для лактобактерий и 48 раз для бифидобактерий.

Двухстадийная модель биотрансформации дрожжевого сырья с индуцированными условиями автолиза и последовательной активацией ферментативного профиля дрожжей ускоряет кинетику ферментативных реакций в 2 раза, способствует увеличению степени конверсии белка на 50−55%, содержания свободных аминокислот — на 70%, нуклеиновых компонентов — на 30%, витаминов группы В — на 40 — 350%.

3 Разработаны рецептуры экономически перспективных питательных сред с высокой ростстимулирующей активностью в отношении лактои бифидобактерий, основы которых в качестве источников азотистого питания содержат многосубстратные гидролизаты белковосодержащих отходов иммунобиологической промышленности.

4 По результатам исследования биологических свойств, определяющих расширение спектра традиционных регламентированных требований, установлены в качестве перспективных производственно-ценные штаммы L. fermentum 90Т-С4, В. adolescentis МС-42.

5 Разработанные питательные среды обеспечивают увеличение удельной скорости роста, высокий урожай бактериальных популяций и стабильность основных биологических свойств производственных штаммов лакто-и бифидобактерий.

Практические рекомендации Для получения экономически перспективных панкреатических белковых гидролизатов рекомендуется двухстадийная модель гидролиза многосубстратных белковых основ, обеспечивающая эффективные кинетические параметры процесса и максимальный выход продукта с заданными степенью конверсии белка и аминокислотным составом.

Для конструирования многосубстратных основ рекомендуется использование белковосодержащих отходов иммунобиологической промышленности.

Для культивирования лактобактерий рекомендуется использование мясо-печеночного и казеино-печеночного гидролизатов с глубокой степенью конверсии белка, содержанием аминного азота (0,85±0,05) %, соотношением незаменимых аминокислот к общему содержанию аминокислот в пределах 65−70%.

Для культивирования бифидобактерий рекомендуется использование мясо-печеночного и казеино-печеночного гидролизатов со средней степенью конверсии белка, содержанием аминного азота (0,425±0,025) %, соотношением незаменимых аминокислот к общему содержанию аминокислот в пределах 74−78%.

Для увеличения выхода питательных нутриентов хлебопекарных дрожжей (аминокислот, нуклеиновых компонентов, витаминов группы В) рекомендуется двухстадийная модель биотрансформации дрожжевого сырья с последовательной активацией ферментативного профиля автолизи-рующих дрожжей и воздействием экзогенного ферментного препарата.

Питательные среды, сконструированные согласно разработанным рецептурам с учетом биологической ценности входящих в состав гидролиза-тов, рекомендуются для крупномасштабного периодического глубинного культивирования подобранных производственно-ценных штаммов лакто-и бифидобактерий.