Дипломы, курсовые, рефераты, контрольные...
Срочная помощь в учёбе

Идентификация и биохимическая характеристика геновариантов парэховирусов человека

Диссертация: Идентификация и биохимическая характеристика геновариантов парэховирусов человека
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Суммируя вышесказанное можно заключить, что в результате проведенной работы оптимизирована методика ПЦР для универсального обнаружения парэховирусов разных генотиповвпервые показана циркуляция на территории г. Нижнего Новгорода парэховирусов человекавпервые установлена частота обнаружения парэховирусов человека у детей госпитализированных с ОКИ в г. Нижний Новгород (3,5−10,4% в разные годы… Читать ещё >

Содержание

  • 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 1. 1. Открытие парэховирусов человека, их таксономическое положение
    • 1. 2. Структурная и молекулярная организация парэховирусов
      • 1. 2. 1. Архитектура и физические свойства вириона
      • 1. 2. 2. Организация генома
      • 1. 2. 3. Вирусные протеины
    • 1. 3. Генетические взаимоотношения ПЭВ
      • 1. 3. 1. Генетические взаимоотношения ПЭВ с другими представителями семейства. Р1согпауичс1ае
      • 1. 3. 2. Генетические взаимоотношения ПЭВ с представителями рода Рагескоуггш
      • 1. 3. 3. Генетическое разнообразие и эволюция парэховирусов человека
    • 1. 4. Характеристика ПЭВ инфекции
      • 1. 4. 1. Значимость ПЭВ в инфекционной патологии человека
      • 1. 4. 2. Клинические проявления ПЭВ инфекции
    • 1. 5. Методы обнаружения и типирования ПЭВ
  • 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
    • 2. 1. Исследуемые объекты
    • 2. 2. Обнаружение и типирование РНК парэховирусов методом ОТ-ПЦР
    • 2. 3. Определение нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов кДНК методом секвенирования
    • 2. 4. Объемы проведенных исследований
    • 2. 5. Статистический анализ результатов
    • 2. 6. Нормативно-методические материалы
  • 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
    • 3. 1. Оптимизация универсального метода ОТ-ПЦР для выявления РНК парэховирусов человека и его апробация
      • 3. 1. 1. Выбор праймеров
      • 3. 1. 2. Оптимизация условий проведения ПЦР
      • 3. 1. 3. Апробация методики для обнаружения РНКПЭВ на клиническом материале
      • 3. 1. 4. Обнаружение ПЭВ с использованием оптимизированной методики ОТ-ПЦР
    • 3. 2. Разработка и применение методики на основе ПЦР для определения типа ПЭВ
      • 3. 2. 1. Разработка «гнездового» варианта ПЦР для идентификации ПЭВ 1-го, 3-го и 6-го типов
      • 3. 2. 2. Применение ПЦР на основе типовых праймеров для идентификации ПЭВ 1-го, 3-го и 6-го типов
    • 3. 3. Молекулярная характеристика ПЭВ: анализ на основе нуклеотидных и аминокислотных последовательностей
      • 3. 3. 1. Филогенетический анализ российских изолятов парэховирусов человека
      • 3. 3. 2. Анализ аминокислотной последовательности фрагментов капсидных белков УР1 и УРЗ

Идентификация и биохимическая характеристика геновариантов парэховирусов человека (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Актуальной проблемой современной биохимии является развитие методов генодиагностики, в том числе для заболеваний, вызываемых некультивируемыми или трудно культивируемыми микроорганизмами и вирусами. Такими трудно культивируемыми вирусами, для которых в нашей стране отсутствуют диагностические тест-системы, являются парэховирусы человека.

Парэховирусы человека (сем. Picornaviridae, род Parechovirus), первоначально классифицированные как вирусы ЕСН022 и ЕСН023 в пределах рода Enterovirus, были открыты R. Wigand и A. Sabin в 1956 году. Подобно энтеровирусам, парэховирусы являются причиной возникновения множества различных инфекционных заболеваний человека, таких как серозный менингит, миокардит, экзантема, миозит, сепсисоподобное заболевание новорожденных, лихорадка, острый гастроэнтерит и респираторные заболевания [71, 96]. Основной группой риска по заболеванию парэховирусной инфекцией являются дети в возрасте до 5 лет [35, 54, 15]. Широкая распространенность и значимость ПЭВ в инфекционной патологии детей первых лет жизни определяют пристальное внимание исследователей к данным вирусам во всем мире. Особое внимание уделяется совершенствованию методов генодиагностики ПЭВ инфекции, в частности методов на основе амплификации нуклеиновых кислот, специфичность и чувствительность которых неразрывно связана со знанием генетического разнообразия возбудителя и с оптимизацией условий проведения ферментативной реакции.

Парэховирусы человека, циркулирующие в мире, характеризуются значительным генетическим разнообразием, заключающемся в существовании как минимум 16-ти типов [www.picornaviridae.com]. Наличие такого количества типов затрудняет разработку ПЦР для выявления и типирования РНК ПЭВ и делает необходимым изучение вариабельности нуклеотидных последовательностей генома штаммов, циркулирующих на разных территориях.

Важным направлением биохимических исследований является изучение организации биологических структур. Парэховирусы являются недостаточно изученным объектом. Они отличаются от энтеровирусов не только организацией генома, но и структурно-функциональными особенностями капсидных белков [95, 96, 109]. Получение новых знаний о первичной и вторичной структуре белков различных геновариантов парэховирусов будет способствовать решению проблемы их узнавания на молекулярном уровне.

В России исследований по изучению разнообразия парэховирусов до начала наших исследований не проводилось в связи с отсутствием диагностических систем и лабораторных методик для обнаружения ПЭВ, что и определило направление исследований данной работы.

Целью исследования явилась разработка методов на основе ПНР для обнаружения и типовой идентификации парэховирусов человека и биохимическая характеристика их геновариантов.

Задачи исследования.

1. На основе анализа нуклеотидных последовательностей генома ПЭВ, представленных в ОепВапк, провести теоретическую оценку известных праймеров для детекции РНК ПЭВ разных типов методом ОТ-ПЦР. Выбрать эффективную пару универсальных праймеров для амплификации консервативного участка 5'НТР генома ПЭВ, оптимизировать условия постановки реакции, апробировать метод на клиническом материале.

2. С использованием оптимизированного метода ОТ-ПЦР провести поиск ПЭВ у детей с острым гастроэнтеритом, оценить частоту их обнаружения.

3. Разработать метод идентификации ПЭВ 1-го, 3-го и 6-го типов на основе «гнездовой» ПЦР области УР1 генома. Определить типы парэховирусов и их распределение.

4. Установить первичную структуру нуклеотидных последовательностей фрагментов 5'НТР и области УРЗ-УР1 генома нижегородских изолятов парэховирусов, изучить их вариабельность.

5. На основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генома провести филогенетический анализ штаммов, определить генотипы ПЭВ 1-го типа.

6. Проанализировать предсказанные аминокислотные последовательности фрагментов С-концевого участка белка УРЗ и >1-концевого участка белка УР1 ПЭВ различных генотипов.

Научная новизна работы.

С использованием оптимизированного метода ОТ-ПЦР впервые, на примере г. Нижнего Новгорода, показана циркуляция парэховирусов среди населения Россииустановлена частота обнаружения ПЭВ у детей с острой кишечной инфекцией, равная 3,5−10,4%, в разные годы.

Разработан авторский метод идентификации ПЭВ трех наиболее распространенных (1-го, 3-го и 6-го) типов, применение которого впервые показало доминирование в нижегородской популяции парэховирусов ПЭВ 1 -го типа.

Впервые определены нуклеотидные последовательности фрагментов генома 5'НТР и области УРЗ-УР1 российских изолятов парэховирусов человека, которые депонированы в ОепВапк/ЕМВЬЛЖВ1 под номерами 1Р330 795−1Р330 833,1(2 437 842−1(2 437 881, К2 437 883, Л2 437 884, что расширило международную базу нуклеотидных последовательностей генов парэховирусов человека из разных регионов мира.

Впервые с использованием анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента области УРЗ-УР1 генома и, соответственно предсказанных, аминокислотных последовательностей, выявлен и охарактеризован новый 1С генотип ПЭВ 1-го типа, характеризующийся уникальной аминокислотной последовательностью Ы-конца капсидного белка УР1.

Практическая значимость работы.

Методические разработки по оптимизации и апробации на современных штаммах метода ОТ-ПЦР для универсальной детекции РНК парэховирусов человека, могут стать основой создания отечественной ПЦР-тест-системы для диагностики парэховирусной инфекции.

С участием автора составлен проект методических рекомендаций «Молекулярно-генетические исследования при мониторинге энтеровирусной инфекции: III. Обнаружение и генотипирование парэховирусов человека» (вход. ФС Роспотребнадзора № 01/26 461−1от 25.10.2011).

Научные результаты, полученные в ходе выполнения работы, используются в учебном процессе ННГУ им. H.H. Лобачевского при подготовке магистров и аспирантов, обучающихся по специальности 20 201 — биология.

Положения, выносимые на защиту.

Разработана и апробирована панель олигонуклеотидных праймеров, позволяющая в оптимизированных условиях постановки ПЦР проводить универсальную и дифференциальную идентификацию РНК парэховирусов человека.

Разнообразие парэховирусов, циркулирующих на территории Нижнего Новгорода, представлено как минимум четырьмя типами парэховирусов (1-й, 3-й, 4-й, 6-й), с преобладанием парэховирусов 1-го типа.

Идентифицирован новый 1С генотип ПЭВ 1-го типа, имеющий уникальную аминокислотную последовательность N-конца белка VP1 (NAEECKQSI) в позиции 18−26, которая может служить его биохимическим маркером.

Апробация работы:

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:

• X Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (г. Санкт-Петербург, 2007 г.).

• VI Нижегородской сессии молодых ученых (г. Нижний Новгород, 2008 г.);

• научно-практической конференции молодых ученых «Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения» (г. Нижний Новгород, 2011 г.);

• заседаниях Ученого Совета Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени академика И. Н. Блохиной и проблемных научно-практических семинарах института.

Объем и структура диссертации:

Материалы диссертации изложены на 115 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 113 источников литературы отечественных (2) и зарубежных авторов (111). Диссертация иллюстрирована 15 рисунками и 15 таблицами.

ВЫВОДЫ.

1) Оптимизирован и апробирован метод выявления РНК ПЭВ разных генотипов с использованием ПЦР 5'НТР генома, показана эффективность его применения для обнаружения современных штаммов ПЭВ, циркулирующих на территории РФ. Впервые установлена частота обнаружения ПЭВ у детей с гастроэнтеритом в Нижнем Новгороде (3,510,4% в разные годы).

2) Разработан метод идентификации ПЭВ 1-го, 3-го и 6-го типов на основе двухраундовой «гнездовой» ПЦР с использованием которого показано доминированием ПЭВ 1-го типа.

3) Впервые установлены нуклеотидные последовательности фрагментов области VP3-VP1 генома российских (Н. Новгород) ПЭВ (JF330795-JF330833), анализ которых показал существование 3-х генотипов (1АДВ и 1С) ПЭВ 1-го типа.

4) На основании различий в нуклеотидных (14,0−25,0%) и аминокислотных (11,2−24,1%) последовательностях ПЭВ 1-го типа выделен новый генотип 1С.

5) Установлена высокая типоспецифическая консервативность С-концевого участка белка VP3, свидетельствующая о его важной роли в цикле репродукции парэховирусов.

6) Показано, что N-концевой участок характеризуется уникальной аминокислотной последовательностью (NAEECKQSI) в позициях 18−26 может служить биохимическим маркером нового 1С генотипа ПЭВ 1-го типа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Значимость парэховирусов в инфекционной кишечной паталогии человека, отсутствие отечественных тест-систем и лабораторных методов для обнаружения и типовой дифференциации данных вирусов, отсутствие данных о молекулярно-биологических свойствах ПЭВ, циркулирующих на территории нашей страны, определили актуальность проведенного исследования.

Настоящая работа посвящена оптимизации и разработке методов на основе ПЦР для выявления и генотипирования парэховирусов, с использованием которых были получены первые и единственные данные о циркуляции ПЭВ на территории России, их молекулярных свойствах и генетическом разнообразии.

В ходе работы для достижения поставленной цели решались задачи по анализу нуклеотидных последовательностей генома ПЭВ, представленных в ОепВапк, выбору универсальной пары праймеров для амплификации фрагмента к ДНК генома ПЭВ, оптимизации физико-химических параметров ее проведения и применению методики при обследовании детей с ОКИ. Важной задачей исследования явилась разработка методики на основе ПЦР для идентификации ПЭВ 1-го, 3-го и 6-го типов, которая включила конструирование типоспецифических праймеров, оптимизацию постановки реакции, и проведение с ее использованием генотипирования выявленных ПЭВ для установления спектра и распределения генотип/серотипов. Отсутствие сведений о разнообразии российских ПЭВ, их биохимических и молекулярно-генетических особенностях, послужило основанием для постановки третьего блока задач, включающего: установление первичной структуры нуклеотидных последовательностей фрагментов 5'НТР и области УРЗ-УР1 генома ПЭВ разных типовизучение их филогенетических отношений с мировыми штаммамианализ переведенных аминокислотных последовательностей фрагментов иммунодоминантного белка УРЗ и протомерсвязывающего домена белка УР1 ПЭВ различных генотипов.

На первом этапе исследования была проведена работа по оптимизации универсального метода ОТ-ПЦР для выявления РНК парэховирусов человека и его апробация. В первую очередь была осуществлена теоретическая оценка праймеров, предложенных в научной литературе, с учетом их специфичности в отношении генома ПЭВ и универсальности по отношению к известным типам парэховирусов человека, а также удовлетворяющих требованию эффективности полимеразной цепной реакции. Всего было проанализировано пять пар праймеров, комплементарных участкам генома в области 5'НТР, который является наиболее консервативным регионом генома парэховирусов человека. По результатам формального анализа нами была выбрана пара праймеров К28 и R30, предложеных М. Oberste с соавторами в 1999 году для выявления ПЭВ, пассированых в культуре ткани. Поскольку праймеры были сконструированы на основе последовательностей генома только двух типов ПЭВ больше 10 лет назад, был проведен их детальный анализ, по результатам которого установлено, что участок генома ПЭВ различных типов в области прямого праймера К28 характеризуется незначительной вариабельностью в связи с чем прямой праймер К28 был оставлен нами без изменения. Анализ нуклеотидной последовательности в области обратного праймера R30 выявил ее уникальный абсолютный консерватизм у всех 8-ми типов ПЭВ.

Установленная универсальность праймеров К28 и R30 определила их выбор для использования в нашей дальнейшей работе. Данная пара фланкирует участок генома в 5'-нетранслируемом регионе (5'НТР), размер получаемого фрагмента равен 256 п.н. (по HPEV1 Harris).

Далее был проведен расчет параметров проведения ПЦР для выявления РНК ПЭВ в копрофильтратах, где предполагается наличие генетического материала различных кишечных вирусов, возможность неспецифического отжига праймеров и получения ложноположительных результатов. Проведена оптимизация физико-химических параметров постановки реакции, которая заключалась в теоретическом и эмпирическом подборе температуры отжига праймеров и использовании TagF-ДНК-полимеразы при концентрации Mg, равной 1,5 мМмоля, что позволило обеспечить достаточную специфичность и эффективность реакции в следующем режиме: 94 °C — 15 мин, (94°С-10 с, 48°С-10 с, 72°С-10 с) х 42.

В связи с отсутствием в России референтных штаммов ПЭВ и контрольных образцов, содержащих парэховирусы, для апробации оптимизированной методики обнаружения РНК ПЭВ на клиническом материале, была взята случайная выборка проб фекалий детей с острым гастроэнтеритом, отрицательных при ПЦР-тестировании на другие кишечные вирусы. Выбор группы детей, госпитализированных с диагнозом ОКИ, основывался на данных научной литературы, в которых указывалось, что наибольшее количество случаев ПЭВ инфекции было зарегистрировано именно у детей с ОГЭ. При исследовании 140 проб были обнаружены образцы, в которых амплифицировался специфический фрагмент кДНК размером 257 п.н. Специфичность метода была подтверждена секвенированием фрагментов кДНК, амплифицированных из 11-ти случайно выбранных проб. С использованием оптимизированного метода ОТ-ПЦР, нами были впервые проведены исследования по обнаружению РНК ПЭВ у 5881 детей, госпитализированных с ОКИ в инфекционный стационар г. Нижнего Новгорода в 2006 — 2011 гг. РНК парэховирусов была выявлена у 347 детей, что составило 3,5−10,4% случаев инфекции в разные годы.

На втором этапе работы была проведена разработка ПЦР-методики для идентификации наиболее часто встречающихся и клинически значимых ПЭВ 1-го, 3-го и 6-го типов. «Генетическое серотипирование» парэховирусов, так же как и других пикорнавирусов, проводят путем анализа нуклеотидной последовательности области, кодирующей капсидный белок VP1, которая характеризуется высокой, по сравнению с 5'НТР генома, вариабельностью. В связи с этим для повышения специфичности реакции генотипирования штаммов ПЭВ мы разработали двухраундовый «гнездовой» вариант ПЦР.

Для постановки первого раунда ПЦР были выбраны олигонуклеотиды, предложенные и использовавшиеся в 2000;2005 гг. Benschop К. с соавторами.

Это праймеры VPl-parEchoFl (2332−2349 и.о.) и VPl-parEchoRl (3071−3090 и.о.), которые фланкируют участок генома размером 759 н.о. Анализ данных праймеров на специфичность в отношении нуклеотидных последовательностей современных штаммов ПЭВ показал необходимость их модификации — в прямой праймер введены 3 вырожденных основания в обратный праймер введены 2 вырожденных основания. На следующем этапе работы проведена оптимизация условий ПЦР первого раунда. В ходе серии постановок реакции ПЦР в пределах температурного диапазона 42°С-52°С с шагом в 2 °C была определена наиболее эффективная температура амплификации, составившая 48 °C. Амплификацию проводили в режиме: 94 °C -15 мин (94°С-10 с, 48°С-10 с, 72°С-10 с) х 42.

Поскольку в научной литературе отсутствует информация о применении для генотипирования ПЭВ типоспецифичных праймеров, то для проведения второго раунда ПЦР нами были созданы собственные праймеры, специфичные в отношении генома ПЭВ 1-го, 3-го и 6-го типов. Для подбора праймеров мы оперировали участком генома VP1 размером 759 п. о., (позиции 2332−3090), который фланкирован праймерами первого раунда ПНР.

При конструирования праймеров, специфичных в отношении генома парэховирусов человека 1-го, 3-го и 6-го типов, для каждого типа была создана сессия нуклеотидных последовательностей, включившая геномы штаммов ПЭВ, различающихся по временным и географическим характеристикам. По результатам сравнительного анализа выровненных последовательностей методом Clustal W в программе Mega 4.0 и внесения вырожденных оснований были созданы праймеры для ПЭВ 1-го типа — HPEV1 °F (19 н.о.) и HPEV1R (17 и.о.), для ПЭВ 3-го типа — HPEV3 °F (19 н.о.) и HPEV3R (18 и.о.), для ПЭВ 6-го типа — праймеры HPEV6 °F (21 н.о.) и HPEV6R (17 н.о.) Специфичность сконструированных праймеров в отношении геномов ПЭВ 1-го, 3-го и 6-го типов была подтверждена путем сравнительного анализа последовательности олигонуклеотидов с соответствующими последовательностями области VP1 генома ПЭВ других типов.

После теоретического расчета и эмпирического подбора параметров постановки реакции была проведена апробация методик с использованием РНК ПЭВ 1-го, 3-го, 6-го типов, идентифицированных с помощью секвенирования. Результаты теоретической и практической апробации свидетельствовали о специфичности разработанного метода на основе ПЦР для дифференциального обнаружения РНК ПЭВ 1-го, 3-го и 6-го типов.

С помощью разработанного метода идентификации ПЭВ 1-го, 3-го и 6-го типов было исследовано 132 ПЭВ-содержащих образца, собранных на территории г. Нижнего Новгорода в 2006;2010 гг. Расчет распределения ПЭВ разных типов показал, что доминирующее положение в нижегородской популяции занимают ПЭВ 1-го типа.

Таким образом, применение разработанной нами методики идентификации типа ПЭВ, позволило впервые показать циркуляцию на территории Нижнего Новгорода ПЭВ 1-го, 3-го и 6-го типов, что свидетельствует о генетической гетерогенности местной популяции ПЭВ. Доминирование ПЭВ 1-го типа и представительство ПЭВ 6-го типа и 3-го типов согласуются с данными о широком распространении этих типов ПЭВ в мире.

На третьем этапе работы был проведен анализ фрагментов нуклеотидных и аминокислотных последовательностей изолятов парэховирусов человека разных типов — 82 фрагментов кДНК 70 изолятов ПЭВ в областях генома, кодирующих 5'НТР (11 последовательностей) и УР1 (71 последовательность). Для 6 изолятов были определены последовательности для двух участков генома. Фрагменты депонированы в базу данных ОепВапк/ЕМВЬ/ ББВ! под номерами ^330 795-^330 833, 1(3 437 842−1(2 437 881, 10 437 883,437 884, что расширило международную базу нуклеотидных последовательностей генов парэховирусов человека из разных регионов мира.

Филогенетический анализ показал, что большинство нижегородских вариантов ПЭВ 1-го типа принадлежит генотипу 1 В, который в последние годы распространен во многих странах. Нижегородская популяция ПЭВ генотипа 1 В филогенетически неоднородна. Среди этих вирусов выделяется три группы (условно 1В/№ 4, — 1В/ЫЫ3), достоверность выделения которых подтверждается высокой бутстрэп-поддержкой. Для вирусов, представляющих эти группы, уровень гомологии нуклеотидных последовательностей с зарубежными или нижегородскими, входящими в другие группы, ПЭВ 1 В не превышал 95%.

Шесть ПЭВ 1-го типа, выявленных в Нижнем Новгороде в 2005, 20 082 010 гг., сформировали отдельный кластер. Уровень дивергенции нуклеотидных последовательностей этих вирусов от охарактеризованных вирусов генотипа 1А составил 18,3−25,0%, от вирусов генотипа 1В — 14,023,5%. Такие различия дают основание предполагать наличие третьего генотипа ПЭВ 1-го типа, условно — 1С. При построении филогенетического древа, основанного на анализе 5'НТР генома, ПЭВ генотипа 1С также образуют отдельную группу. Уровень гомологии нуклеотидных последовательностей 5'НТР генома вирусов генотипа 1 В с ближайшим родственным штаммом был выше алогичного показателя, полученного при анализе фрагмента УРЗ-УР1 генома, и составил, в среднем, 91,0%. Однако достоверность существования данной группы, образованной вирусами генотипа 1С, подтверждается высокой бутстрэп-поддержкой.

Таким образом, в результате филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей генома показано генетическое разнообразие ПЭВ 1-го типа, выявленных в Нижнем Новгороде в 2005;2010 гг.- идентифицированы два известных генотипа ПЭВ-1 (1А, 1В) — показана циркуляция ПЭВ 1 В типа, относящихся к разным филогенетическим линиямобнаружен вариант ПЭВ 1 -го типа, который на основании показателей вариабельности нуклеотидных последовательностей двух областей генома (5'НТР и области УРЗ-УР1) может быть охарактеризован, как новый 1С генотип ПЭВ 1-го типа.

Использованный нами способ амплификации и генотипирования по УРЗ-УР1 области генома ПЭВ позволил провести анализ первичной структуры С-конца УРЗ и Ы-конца УР1.

При сравнительном анализе первичной структуры фрагмента УРЗ, установлен консерватизм аминокислотных последовательностей, принадлежащих разных генотипам ПЭВ 1-го типа, включая генотип 1С, и значительная вариабельность среди последовательностей ПЭВ, принадлежащим разным типам.

При анализе аминокислотных последовательностей фрагмента белка УР1 у ПЭВ генотипов 1 В и 1С, в сравнении с ПЭВ генотипа 1А, установлены характерные замены аминокислотных остатков в различных позициях. У всех шести нижегородских ПЭВ генотипа 1С на исследуемом участке УР1 идентифицировалась оригинальная аминокислотная последовательность, отличающая их как от ПЭВ 1А, так и от ПЭВ 1 В, что подтверждает правомерность выделения этой группы вирусов в отдельный генотип.

Обнаруженный новый генотип 1С ПЭВ 1-го типа характеризуется уникальной аминокислотной последовательностью (ЫЛЕЕСКС^) Оконца капсидного белка УР1.

Суммируя вышесказанное можно заключить, что в результате проведенной работы оптимизирована методика ПЦР для универсального обнаружения парэховирусов разных генотиповвпервые показана циркуляция на территории г. Нижнего Новгорода парэховирусов человекавпервые установлена частота обнаружения парэховирусов человека у детей госпитализированных с ОКИ в г. Нижний Новгород (3,5−10,4% в разные годы) — разработан гнездовой вариант метода ОТ-ПЦР для генотипирования ПЭВ, позволившая установить циркуляцию на территории г. Нижнего Новгорода как минимум трех типов ПЭВ, что в свою очередь свидетельствует о генетической гетерогенности местной популяции парэховирусовпоказано доминирование ПЭВ 1-го типа и значительное представительство ПЭВ 6-го и 3-го типовпроведено секвенирование, позволившее впервые определить нуклеотидные последовательности российских изолятов ПЭВпроведен филогенетический анализ определенных последовательностей, позволивший установить их генетическое разнообразие и родственные отношения с известными мировыми штаммамивыявлена группа ПЭВ 1-го типа, которая на основании показателей вариабельности нуклеотидных последовательностей двух областей генома (5'НТР и области УРЗ-УР1 генома) и аминокислотной последовательности фрагмента УРЗ-УР1 может быть определен как новый генотип ПЭВ 1-го типа, характеризующийся уникальной аминокислотной последовательностью (ТЧАЕЕСКСШ) Ы-конца капсидного белка УР1, которая может использоваться в качестве биохимического маркера.

Показать весь текст

Список литературы

  1. А.Н. Роль рекомбинации в эволюции энтеровирусов // Вопросы вирусол. 2005. № 3. С.46−52.
  2. Т.Е., Удина И. Г., Зинченко В. В. Анализ полиморфизма ДЕПС с использованием метода полимеразной цепной реакции. // М. 2006. 80с.
  3. Al-Sunaidi М., Williams С.Н., Hughes P. et al. Analysis of a new human parechovirus allows the definition of parechovirus types and the identification of RNA structural domains. // J. Virol. 2007. Vol. 81. No. 2. P. 1013−1021.
  4. Alho A., Marttila J., Ilonen J., Hyypia T. Diagnostic potential of parechovirus capsid proteins // J. Clin. Microbiol. 2003. Vol. 41. No. 6. P. 2294−2299.
  5. Andino R., Rieckhof G. E., and Baltimore D. A functional ribonucleoprotein complex forms around the 5' end of poliovirus RNA. // Cell. 1990. V.63. P. 369 380.
  6. Arola A., Santti J., Ruuskanen O., et al. Identification of enteroviruses in clinical specimens by competitive PCR followed by genetic typing using sequence analysis. // J. Clin. Microbiol. 1996. 34(2):313−318.
  7. Auvinen P., Hyypia T. Echoviruses include genetically distinct serotypes. // J. Gen. Virol. 1990. 71:2133−2139.
  8. Auvinen P., Stanway G., Hyypia T. Genetic diversity of enterovirus subgroups. // Arch. Virol. 1989. 104:175−186.
  9. Baumgarte S., de Souza Luna L.K., Grywna K. Prevalence, types, and RNA concentrations of human parechoviruses, including a six Parechovirus type I stool samples from patients with acute enteritis. // J. Clin. Microbiol. 2008. Vol.46. P.242−248.
  10. Benschop K., Molenkamp R., van der Ham A. et al. Rapid detection of human parechoviruses in clinical samples by real-time PCR. // J. Clin Virol 2008. -41:69−74.
  11. Benschop K. S., Schinkel J., Minnaar R. P. et.al. Human parechovirus infections in Dutch children and the association between serotype and disease severity. // Clin. Infect. Dis. 2006. — Vol. 42. — P. 204−210.
  12. Benschop K. S., Schinkel J., Luken M. E. et.al. Fourth human parechovirus serotype. // Emerg. Infect. Dis. 2006 — Vol.12. — P. 1572−1575.
  13. Benschop K. S., de Vries M., Minaar R. et.al. Comprehensive full length sequence analyses of human parechoviruses: diversity and recombination. // J. Gen. Virol, -2010.-Vol. 91.-P. 145−154.
  14. Birenbaum E., Hadsher R., Kuint J. et.al. Echovirus type outbreak associated with gastrointestinal disease in neonatal intensive care unit. // Am. J. Perinatol. 1997. -V.14.-P. 469−473.
  15. Boivin G., Abed Y., Boucher F. D. Human parechovirus 3 and neonatal infections. // Emerg. Infect. Dis. 2005. — Vol. 11. — P. 103−105.
  16. Boonyakiat Y., Hughes P. J., Ghazi F., and G. Stanway. Arginine-glycine-aspartic acid motif is critical for human parechovirus 1 entry. // J. Virol. 2001. Vol. 75. -P.10 000−10 004.
  17. Calvert J., Chieochansin T., Benschop K. S., et.al. Recombination dynamics of human parechoviruses: investigation of type-specific differences in frequency and epidemiological correlates. // J. Gen. Virol. 2010. — Vol. 91. — P. 1229−1238.
  18. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Nonpolio enterovirus and human parechovirus surveillance in United States, 2006−2008. // MMWR. Morb. Mortal. Rep.-2010. -Dec 10−59(48). P. 1577−1580.
  19. Chen B., Cheng M., Huang T. et.al. Detection and identification of human parechoviruses from clinical specimens. // Diagn. Microbiol, and Infect. Dis.2009. Vol. 65. — P. 254−260.
  20. Chow M., Newman J. F. E., Filman D. et al. Myristylation of picornavirus capsid protein VP4 and its structural significance. // Nature. 1987. — 327:482 486.
  21. Coller B-A. G., Chapman N. M., Beck M. A. et al. Echovirus 22 is an atypical enterovirus.// J. Virol. 1990. — Vol. 64. — P. 2692−2701.
  22. Coller B-A. G., Tracy S. M., Etchison D. Cap-binding complex protein p220 is not cleaved during echovirus 22 replication in HeLa cells. //J. Virol. 1991. -Vol.65.-P. 3903−3905.
  23. Corless C. E., Guiver M., Borrow R. et al. Development an devaluation of a 'realtime' RT-PCR for the detection of enterovirus and parechovirus in CSF and throat swab samples. // J. Med. Virol. 2002. — 67:555−562.
  24. Drexler J. F., Grywna K., Stocker A. et al. Novel human parechovirus from Brazil. // Emerg. Infect. Dis. 2009. — Vol. 15. — P. 310−313.
  25. Eggers H. J., and Tamm L. Spectrum and characteristics of the virus inhibitory action of 2-(a-hydroxybenzyl)-benzimidazole. // J. Exp. Med. 1961. — 113:657 682.
  26. Ehrnst A., Erikson M. Epidemiological features of type 22 echovirus infection. // Scand. J. Infect. Dis. -1993. Vol. 25. — P. 275−281.
  27. Ehrnst, A., Eriksson M. Echovirus type 23 observed as a nosocomial infection in infants. Scand. // J. Infect. Dis. 1996. — 28:205−206.
  28. Faria N. R., de Vries M., van Hemert F. J. et al. Rooting human parechovirus evolution in time. // BMC Evol. Biol. 2009. Jul. — 9: 164.
  29. Forss S., Schaller H. A tandem repeat gene in a picornavirus. // Nucleic Acids Res.- 1982.- 10:6441−6450.
  30. Ghazi F., Hughes P.J., Hyypia T., Stanway G. Molecular analysis of human parechovirus type 2 (formerly echovirus 23). // J. Gen. Virol. 1998. — Vol.79. P. 2641−2650.
  31. Harvala H., Robertson I., McWilliam Leitch C. et al. Epidemiology and clinical association of human Parechovirus respiratory infections. // J. Clin. Microbiol. -2008. Vol. 46. — P. 3446−3453.
  32. Harvala H., Simmonds P. Human parechoviruses: Biology, epidemiology and clinical significance. //J. Clin. Virol. 2009. Vol. 45. — P. 1−9.
  33. Harvala H., Wolthers K.S., Simmonds P. Parechoviruses in children: understanding a new infection. // Curr. Opin. Infect. Dis. 2010. — Vol. 23. — P. 224−230.
  34. Hyypia T., Horsnell C., Maaronen M. et al. A distinct picornavirus group identified by sequence analysis. // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1992. — 89: 8 847 885.
  35. Hyypia T., Hovi T., Knowles N. J. et al. Classification of enteroviruses based on molecular and biological properties. // J. Gen. Virol. 1997. — 78:1−11.
  36. Hyypia T., Maaronen M., Auvinen P., et. al. Nucleic acid sequence relationships between enterovirus serotypes. //Mol.Cell. Probes 1987.-1:169−176.
  37. Hyypia T., Puhakka T., Ruuskanen O., et al. Molecular diagnosis of human rhino virus infection: comparison with virus isolation. // J. Clin. Microbiol. 1998. -36:2081−2083.
  38. Jamison R. M. An electron microscopic study of the intracellular development of echovirus 22. // Arch. Gesamte Virusforsch. 1974. — 44:184−194.
  39. Jang S.K., Davies M.V., Kaufman R.J. et al. Initiation of protein synthesis by internal entry of ribosomes into the 5' nontranslated region of encephalomyocarditis virus RNA in vivo // J. Virol. 1989. — Vol.63. — P. 1651 -1660.
  40. Joki-Korpela P., Hyypia T. Diagnosis and epidemiology of echovirus 22 infections. // Clin. Infect. Dis. 1998. — Vol. 26. — P. 129−136.
  41. Joki-Korpela P., Marjomaki V., Krogerus C. et.al. Entry of human parechovirus 1. // J. Virol. 2001. — Vol.75. — P. 1958−1967.
  42. Joki-Korpela P., Roivanen M., Lankinen H. et al. Antigenic properties of human parechovirus 1 // J. Gen. Virol. 2000. — Vol.81. — P. 1709−1718.
  43. Katano H., Kano M., Nakamura T. et al. A novel real-time PCR system for simultaneous detection of human viruses in clinical samples from patients with uncertain diagnoses. // J. Med. Virol. 2011. — 83(2):322−330.
  44. Khamrin P., Okame M., Thongprachum A. et al. A single-tube multiplex PCR for rapid detection in feces of 10 viruses causing diarrhea. // J. Virol. Methods. -2011. 73(2):390−393.
  45. Khetsuriani N., Lamonte-Fowlkes A., Oberste M.S. et al. Enterovirus surveillance-United States, 1970−2005. // MMWR Surveill. Summ. 2006. -55(8). -P.l-20.
  46. King A. M., Brown Q. F., Christian P. et. al. Picornaviridae. // Virus taxonomy. Seventh Report of the International Committee for the Taxonomy of Viruses. -1999.-p. 996.
  47. Knipe D.M. et al. Fields Virology, 5th Edition // 2007.
  48. Krogerus C., Egger D., Samuilova O. et.al. Replication complex of human parechovirus 1. // J. Virol. 2003. — Vol.77. — P. 8512−8523.
  49. Krogerus C., Samuilova O., Poyry T. et al. Intracellular localization and effects of individually expressed human parechovirus 1 non-structural proteins. // J. Gen. Virol. 2007. — Vol. 88. — P. 831−841.
  50. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment // Briefings in Bioinformatics. -2004. Vol. 5. — P. 150−163.
  51. Landry M. The molecular diagnosis of parechovirus infection: Has the time come? // Clin. Infect, dis. 2010. — Vol. 50. — P. 362−363.
  52. Legay V., Chomel J. J., Fernandez E. et al. Encephalitis due to human parechovirus type 1. // J. Clin. Virol. 2002. — 25:193−195.
  53. Li L., Victoria J., Kapoor A. et al. Genomic characterization of novel human parechovirus type. // Emerg. Infect. Dis. 2009. — Vol. 15. — P. 288−291.
  54. Lim K. A., Benyesh-Melnick M. Typing of viruses by combinations of antiserum pools. Application to typing of enteroviruses (coxsackie and ECHO). // J. Immunol. 1960. — 84:309−317.V
  55. Ljubin-Sternak S., Juretic E., Santak M., et. al Clinical and molecular characterization of a parechovirus type 1 outbreak in neonates in Croatia. // J. Med. Virol.-2011.-Vol. 83.-P. 137−141.
  56. Mahy B.W.J, et al. Encyclopedia of Virology (Third Edition) // Oxford. 2008.
  57. Mantke O., Kallies R., Niklasson B. et al. A new quantitative real-time reverse transcriptase PCR assay and melting curve analysis for detection and genotyping of Ljungan virus strains. // J. Virol. 2007. — 141:71−77.
  58. Mayo M. A., Pringle C. R. Virus taxonomy 1997. // Journal of General Virology. — 1998. — 79: 649−657.
  59. Nakao T., Miura R., Sato M. ECHO virus type 22 infection in a premature infant. // J. Exp. Med. 1970. — 102(1):61−68.
  60. Nateri A. S., Hughes P. J. and Stanway G. In vivo and in vitro identification o structural and sequence elements of the human parechovirus 5'untranslated region required for internal initiation. // J. Virol. 2000. — Vol.74. — P.6269−6277.
  61. Niklasson B., Hornfeldt B., Lundman B. Could myocarditis, insulin-dependent diabetes mellitus, and Guillain-Barre syndrome be caused by one or more infectious agents carried by rodents? // Emerging. Infect. Dis. 1998. -Vol. 4. P. 187−193.
  62. Niklasson B., Kinnunen L., Hornfeldt B. et. al. A new picornavirus isolated from bank voles (Clethrionomys glareolus). // Virology 1999. — 255:86−93.
  63. Niklasson B., Samsioe A., Papadogiannakis N. et al. Association of zoonotic Ljungan virus with intrauterine fetal deaths. // Birth. Defects. Res. 2007. -79:488−493.
  64. Nix W.A., Maher K., Johansson E.S. et al. Detection of all known parechoviruses by real time-PCR. // J. Clin. Microbiol. 2008. — 46:2519−2524.
  65. Pham N.T.K., Trinh Q.D., Chan-It W. et al. A novel RT-multiplex PCR for detection of Aichi virus, human parechovirus, enteroviruses, and human bocavirus among infants and children with acute gastroenteritis. // J. Virol. Methods. 2010. — 169(l):193−7.
  66. Pham N.T.K., Trinh Q.D., Khamrin P. Diversity of Human parechoviruses isolated from Stool Samples Collected from Thai children with acute gastroenteritis. // J.Clin. Microbiol. 2010. — Vol.48. — P. 115−119.
  67. Pham N.T.K., Trinh Q.D., Takanashi S. et. al. Novel human parechovirus Sri Lanka. //Emerging. Infect. Dis. 2010. — Vol. 16. — P. 130−132.
  68. Pineiro L., Vicente D., Montes M. et. al. Human parechoviruses in infants with systemic infection. // J. Med. Virol. 2010. Vol.82. — P. 1790−1796.
  69. Read S. J., Jeffery K. J. M., Bangham C. R. M. Aseptic meningitis and encephalitis: the role of PCR in the laboratory. // J. Clin. Microbiol. 1997. -35:691−696.
  70. Rueckert R.R. Picornaviridae: the viruses and their replication // Fields Virology, Third Edition 1996. — P. 613−616.
  71. Ryan M.D., Flint M. Virus-encoded proteinases of the picornavirus super-group //J. Gen. Virol. 1997. — Vol. 78. — P. 699−723.
  72. Samuilova O., Krogerus C., Poyry T. et al. Specific interaction between human parechovirus nonstructural 2A protein and viral RNA. // J. Biol. Chem. 2004. -279(36):37 822−31.
  73. Sanden S., Bruin E., VennemaH. et.al. Prevalence of Human parechovirus in Netherlands in 2000 to 2007 // J. Clin. Microbiol. 2008. — V.46. — P. 2884−2889.
  74. Sedmak G., Nix A.W., Jentsen J. et.al. Infant deth associated with human parechovirus infection in Wisconsin. // Clin. Infect. Dis. 2010. — Vol.50. — P. 357−361.
  75. Seitsonen J., Susi P., Heikkila O. et.al. Interaction of avP3 and avP6 Integrins with Human Parechovirus 1 // J. Virol. 2010. — Vol. 84. — P. 8509−8519.
  76. Shaver D. N., Barron A. L., Karzon D. T. Distinctive cytopathology of ECHO viruses types 22 and 23. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1961. — Vol. 106. P. 648 652.
  77. Shimizu C., Rambaud C., Cheron G. et al. Molecular identification of viruses in sudden infant death associated with myocarditis and pericarditis. // J. Pediatr. Infect. Dis. 1995. — 14:584 588.
  78. Stanway G. Structure, function and evolution of picornaviruses. // J. Gen. Virol. -1990. Vol. 71. — P. 2483−2501.
  79. Stanway G., Brown F., Christian P. et al. Family Picornaviridae. // In Virus Taxonomy, Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. 2005. — P. 757−778.
  80. Stanway G., Hyypia T. Parechoviruses. // J. Virol. 1999. — Vol. 73. — P. 52 495 254.
  81. Stanway G., Joki-Korpela P. & Hyypia T. Human parechoviruses biology and clinical significance. // Rev. Med. Virol. — 2000. Vol. 10. — P. 57−69.
  82. Stanway G., Kalkkinen N., Roivainen M. et.al. Molecular and biological characteristics of echovirus 22: a representative of a new picornavirus group. // J. Virol. 1994. — Vol. 68. — P. 8232−8238.
  83. Takao S., Fukuda S., Shimasu S. et al. The isolation of human parechovirus 1 from cases of acute respiratory illness in children.// Jpn. J. Infect. Dis. 2001. -Vol. 54. — P.85−88.
  84. Tamura K., Dudley J., Nei M. et al. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution // -2007.-24: 1596−1599.
  85. Tamura K., Peterson D., Peterson N. et al. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution // 2011. — 28: 2731−2739.
  86. Tapia G., Cinek O., Witso E. et al. Longitudinal observation of parechovirus in stool samples from Norwegian infants. // J. Med. Virol. 2008. — Vol. 80. — P. 1835−1842.
  87. Tauriainen S., Oikarinen S., Taimen K. et al. Temporal relationship between human parechovirus 1 infection and otitis media in young children. // J. Infect. Dis. 2008. — Vol. 198. — P. 35−40.
  88. Tolf C., Gullberg M., Johansson E.S. et al. Molecular characterization of a novel Ljungan virus (Parechovirus, Picornaviridae) reveals a fourth genotype and indicates ancestral recombination. // J. Gen. Virol. 2009. — Vol. 90. — no. 4. -843−853.
  89. Trant C. M., Jamison R. M. Electron microscopic study of the morphogenesis of echovirus 23. // Exp. Mol. Pathol. 1975. — 22:55−64.
  90. Verboon-Maciolek M.A., Groenendaal F., Hahn C. et al. Human parechovirus causes encephalitis with white matter injury in neonates. // Ann. Neurol. 2008. -64:266−273.
  91. Watanabe K., Oie M., Higuch, M. et al. Isolation and characterization of novel human parechovirus from clinical samples. // Emerg. Infect. Dis. 2007. — Vol. 13.-P. 889−895.
  92. Williams C. H., Panayiotou M., Girling G. D. et al. Evolution and conservation in human parechovirus genomes. // J. Gen. Virol. 2009. — Vol. 90. — P. 17 021 712.
  93. Wigand, R., Sabin A. B. Properties of ECHO types 22, 23, and 24 viruses. // Arch. Gesamte Virusforsch. 1961. — Vol. 11. — P. 224−247.
  94. Wolthers K., Benshop K.S.M., Schinkel J. et al. Human parechoviruses as animportant viral cause of sepsislike illness and meningitis in young children. // Clin. Infect. Dis. 2008. — Vol 47. — P. 358−363.
  95. Yamashita T., Sakae K., Tsuzuki H. Complete nucleotide sequence and genetic organization of Aichi Virus, a distinct member of the Picornaviridae Associated with Acute Gastroenteritis in Humans // J. Virol. 1998. — Vol.72. — P. 84 088 412.
  96. Zhong H., Lin Y., Sun J. et al. Prevalence and genotypes of human parechovirus in stool samples from hospitalized children in Shanghai, China, 2008 and 2009. // J. Med. Virol. 2011. — Vol.83 — P. 1428−1434.
Заполнить форму текущей работой

Заказал и сдал!