Дипломы, курсовые, рефераты, контрольные...
Срочная помощь в учёбе

Сравнительный структурно-функциональный анализ генов тирозинаминотрансферазы человека и крысы

Диссертация: Сравнительный структурно-функциональный анализ генов тирозинаминотрансферазы человека и крысы
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

2. Выделение плазмидной дцДНК с использованием щелочного лизиса. 3. Выделение геномной ДНК из гепатоцитов. Регуляция экспрессии генов TAT глюкокортикоидами. Синергичное взаимодействие глюкокортикоидного рецептора с другими 23 транскрипционными факторами. Получение препаратов ДНК с использованием полимеразной цепной 50 реакции2. 3. 1. Использование техники «горячего старта» для повышения… Читать ещё >

Содержание

  • СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
  • 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 1. 1. Регуляция экспрессии генов стероидными гормонами
      • 1. 1. 1. Структура и функции стероидных гормонов
      • 1. 1. 2. Строение рецептора глюкокортикоидов
      • 1. 1. 3. Изменение структуры хроматина под действием глюкокортикоидов
      • 1. 1. 4. Участки ДНК, ответственные за связывание с рецептором 21 глюкокортикоидов
      • 1. 1. 5. Синергичное взаимодействие глюкокортикоидного рецептора с другими 23 транскрипционными факторами
    • 1. 2. Ген тирозинаминотрансферазы — модель для изучения молекулярных 25 механизмов регуляции экспрессии генов
      • 1. 2. 1. Строение и свойства тирозинаминотрансферазы
      • 1. 2. 2. Структура генов TAT
      • 1. 2. 3. Регуляция экспрессии генов TAT глюкокортикоидами
  • 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
    • 2. 1. Материалы и реактивы, использованные в работе
    • 2. 2. Выделение препаратов ДНК из образцов клеток и тканей
      • 2. 2. 1. Выделение геномной ДНК
        • 2. 2. 1. 1. Выделение геномной ДНК из тканей млекопитающих
        • 2. 2. 1. 2. Выделение геномной ДНК из крови
        • 2. 2. 1. 3. Выделение геномной ДНК из гепатоцитов
      • 2. 2. 2. Выделение ДНК из клеток Е. соИ
        • 2. 2. 2. 1. Выделение плазмидной дцДНК с использованием термического лизиса
        • 2. 2. 2. 2. Выделение плазмидной дцДНК с использованием щелочного лизиса
        • 2. 2. 2. 3. Выделение плазмидной дцДНК с использованием ионообменной 47 хроматографии
        • 2. 2. 2. 4. Выделение оцДНК бактериофага М13 из бактериальных клеток
    • 2. 3. Получение препаратов ДНК с использованием полимеразной цепной 50 реакции
      • 2. 3. 1. Использование техники «горячего старта» для повышения специфичности 51 полимеразной цепной реакции
      • 2. 3. 2. Использование изменяющейся температуры гибридизации для повышения 52 выхода и специфичности реакции
      • 2. 3. 3. Использование глицерина для понижения температуры плавления дцДНК 56 и стабилизации ДНК-полимеразы
      • 2. 3. 4. Использование термостабильной ДНК-полимеразы с 3−5' экзонуклеазной 60 активностью для амплификации длинных фрагментов ДНК
    • 2. 4. Ферментативная обработка препаратов ДНК
      • 2. 4. 1. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
      • 2. 4. 2. Гидролиз ДНК МипдВеап нуклеазой
      • 2. 4. 3. Введение радиоактивной метки в ДНК
        • 2. 4. 3. 1. С использованием фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е. соИ
        • 2. 4. 3. 2. С использованием полинуклеотидкиназы бактериофага Т
      • 2. 4. 4. Лигирование фрагментов дцДНК с использованием ДНК-лигазы 64 бактериофага Т
    • 2. 5. Анализ и очистка препаратов ДНК методами гель-электрофореза
      • 2. 5. 1. Электрофорез в гелях агарозы
      • 2. 5. 2. Электрофорез в полиакриламидном геле
      • 2. 5. 3. Разделение цепей дцДНК электрофорезом в полиакриламидном геле
      • 2. 5. 4. Выделение ДНК из гелей электроэлюцией в ячейках фирмы «ISCO»
      • 2. 5. 5. Выделение ДНК из агарозного геля методом сорбции на стекловолокне
      • 2. 5. 6. Выделение ДНК из агарозных гелей сорбцией на DEAE-81 целлюлозу в 73 процессе электрофореза
      • 2. 5. 7. Очистка олигонуклеотидов в денатурирующем полиакриламидном геле с 73 непрерывной элюцией и спектрофотометрической детекцией
    • 2. 6. Клонирование фрагментов ДНК в составе бактериальных векторных ДНК
    • 2. 7. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) 78 фрагментов ДНК
      • 2. 7. 1. Методом химической модификации по Максаму-Гилберту
        • 2. 7. 1. 1. В жидкой фазе
        • 2. 7. 1. 2. С использованием сорбции на DEAE-81 целлюлозе
        • 2. 7. 1. 3. Комбинированным методом
      • 2. 7. 2. Методом специфической терминации полимеризации по Сэнгеру
        • 2. 7. 2. 1. Секвенирование оцДНК бактериофага М
        • 2. 7. 2. 2. Секвенирование суперскрученной дцДНК плазмид с использованием 86 щелочной денатурации
        • 2. 7. 2. 3. Секвенирование суперскрученной дцДНК плазмид с использованием 86 денатурации в присутствии гликолей
        • 2. 7. 2. 4. Секвенирование с использованием флюоресцентно меченных праймеров и 87 детекции на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 370А
        • 2. 7. 2. 5. Секвенирование микроколичеств дцДНК с использованием фермента 87 ThermoSequenase
      • 2. 7. 3. Разделение специфически терминированных фрагментов ДНК электрофорезом в денатурирующем полиакриламидном геле
  • 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
    • 3. 1. Определение нуклеотидных последовательностей
      • 3. 1. 1. Определение последовательности района -1990 — -580 п.н. 5'- 91 фланкирующей области гена TAT человека
      • 3. 1. 2. Определение последовательности гена TAT крысы
        • 3. 1. 2. 1. Определение последовательности района 10 350 — 12 289 п. н
        • 3. 1. 2. 2. Определение последовательности района 9298 — 10 355 п. н
        • 3. 1. 2. 3. Определение последовательности района 5622- 9293 п. н
        • 3. 1. 2. 4. Определение последовательности района -19- 5627 п. н
    • 3. 2. Структура гена TAT крысы
    • 3. 3. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов TAT 106 человека и крысы
    • 3. 4. Поиск потенциальных участков связывания факторов регуляции 106 транскрипции в 5'-фланкирующей области гена TAT человека
  • ВЫВОДЫ

Сравнительный структурно-функциональный анализ генов тирозинаминотрансферазы человека и крысы (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

В настоящее время одной из наиболее бурно развивающихся отраслей биологии является «геномика» — генетика, дошедшая в своем пути к элементарным носителям генетической информации до уровня последовательностей нуклеотидов, или наука о нуклео-тидных последовательностях. Наряду с грандиозными успехами, достигнутыми при сек-венировании и анализе геномов отдельных организмов (Caenorhabditis elegans (геном 100 ООО ООО п.н. секвенирован полностью) — Homo sapiensнекоторые виды патогенных простейших) незаслуженно мало внимания уделяется сравнительному анализу гомологичных участков геномов разных видов. В свое время определение аминокислотной последовательности глобинов разных видов позволило сделать фундаментальные открытия в области эволюции белков. Имеющиеся на сегодняшний день многочисленные данные позволяют утверждать, что наибольшие частота и разнообразие эволюционных событий наблюдается не в кодирующих белок областях генома, на эволюцию которых накладываются жесткие ограничения естественного отбора на уровне белка, а в интронах генов, фланкирующих гены (регуляторных) районах и других «некодирующих» участков геномов. Сравнительный анализ последовательностей подобных районов геномов различных видов позволит выявить пути и механизмы эволюции генов и геномов.

Одной из наиболее привлекательных моделей для такого сравнительного анализа являются гены «минорных» белков, экспрессия которых является, как правило, ткане-специфической и находится под контролем различных факторов регуляции транскрипции. Тирозинаминотрансфераза (ТАТ, Ь-тирозин:2-оксоглутаратаминотрансфераза, К.Ф. 2.6.1.5) — пиридоксальфосфат зависимый фермент, катализирующий переаминирование тирозина, является одним из таких белков, механизмы регуляции экспресси гена которого в организме крысы детально изучены (Boshart et al, 1993; Мертвецов, 1990). Экспрессия гена этого белка является такнеспецифической и происходит в основном в печени (в гепа-тоцитах). Уровень экспрессии регулируется посредством нескольких путей передачи межклеточных сигналов, в частности глюкокортикоидами и цАМФ. В 5'-фланкирующей области (до -6000 п.н.) гена ТАТ крысы были локализованы три тканеспецифических энхан-сера транскрипции, два из которых взаимодействуют с комлексом гормон — рецептор глю-кокортикоидов и фактором тканевой специфичности печени HNF3, а один — с CREB и HNF4, т. е. является цАМФ-зависимым (Shinomiya et al, 1984; Jantzen et al, 1987; Danesh et al, 1987; Grange et al, 1991; Boshart et al, 1993; Espinas et al, 1994). В то время как механизмы регуляции экспрессии гена ТАТ крысы изучены в деталях, для гена ТАТ человека в литературе нет данных о выявлении функционирующих энхансеров, контролирующих экспрессию этого гена. Известны лишь небольшие фрагменты нуклеотидной последовательности 5'-фланкирующей области гена ТАТ человека (Rettenmeier et al, 1990). Знание механизмов регуляции экспрессии гена ТАТ человека имеет, наряду с фундаментальным, важное медицинское значение, поскольку может позволить предотвращать или корректировать нарушения регуляции экспрессии гена ТАТ в процессе онтогенеза, приводящие к тяжелому заболеванию — тирозинемии.

Целью настоящей работы являлось выявление функционально значимых участков и эволюционно изменчивых райнов гена тирозинаминотрансферазы путем сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов ТАТ человека и крысы, включающих все экзоны и интроны гена, а также значительные по длине районы 5'- и 3'-фланкирующих областей. Ранее были определены нуклеотидные последовательности фрагмента 5'-фланкирующей области от -3500 до -1900 п.н. (Rettenmeier et al, 1990), последовательности экзонов (Rettenmeier et al, 1990) и интронов (Зеленин, Мертвецов, 1994) гена ТАТ человекаа также нуклеотидная последовательность кДНК, экзон-интронная структура и карта сайтов эндонуклеаз рестрикции гена ТАТ крысы (Shinomiya et al, 1984;

Grange et al, 1985; Hargrove et al, 1989). Задачами работы являлось определение полной нуклеотидной последовательности гена TAT крысы (более 12 ООО п.н.) и района от -1900 до -700 п.н. 5'-фланкирующей области гена TAT человека и сравнительный анализ определенных в работе и ранее известных последовательностей.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Показать весь текст
Заполнить форму текущей работой

Заказал и сдал!