Особенности мембранного пищеварения у карповых рыб

Актуальность проблемы. Как известно, потребность живого организма в питательных веществах подвержена существенным изменениям и зависит от целого ряда факторов окружающей среды. Причем, эта связь более отчетливо прослеживается у холоднокровных животных, в частности у рыб, что обусловлено теснотой их связи со средой обитания как в природных, так и в искусственно создаваемых водоемах (обзоры: Пегель, 1950; Строганов, 1962; Щербина, Казлаускене, 1971; Киселев, 1985; Остроумова, 1986, 1988; Уголев и др., 1986 и мн. др.). Следует особо подчеркнуть, что рыбы являются уникальной группой позвоночных животных не только по необычайно высокому количеству видов, но и по разнообразию объектов питания, а также структурно-функциональной организации пищеварительной системы. Последняя, являясь у рыб к тому же открытой по отношению к внешней среде, предоставляет исследователям удобную возможность изучения реализации гидролитической функции в постоянно изменяющихся экологических условиях (Груздков и др., 1986; Кузьмина, 1985; Уголев, 1978, 1985; Уголев и др., 1986).

В ряде фундаментальных работ показано, что баланс пищевых веществ в организме достигается в результате освобождения нутриентов из структур пищи при ферментативном расщеплении ее макромолекул за счет полостного (обзоры: Пегель, 1950; Пучков, 1954; Вагги]^1-оп, 1957; Строганов, 1962; Краю-хин, 1963; Сорвачев, 1982) и мембранного пищеварения (Уголев, 1960, 1963, 1965, 1967; Уголев, Иезуитова, 1985; Що1еу, Тегикоуа, 1982 и др.), а в ряде случаев — внутриклеточного (обзоры: Коштоянц, 1950; Уголев, 1961, 1963, 1965, 1967 и др.), а также вследствие синтеза новых веществ, в том числе незаменимых. Относительная роль первичных и вторичных нутриентов при этом варьирует в широких пределах (Уголев, 1985, 1986, 1987, 1988).

В рамках новой междисциплинарной науки — трофологии (Уголев, 1980; 19 876) проблемы потребления и ассимиляции нутриентов из окружающей среды предстают в новом свете. Появились реальные возможности для решения целого ряда фундаментальных и прикладных задач, связанных с проблемами идеальной пищи и рационального питания, разработки новых критериев для технологий, лежащих в основе производства и хранения пищи, защиты и сохранения естественных трофических экосистем на основе трофологического анализа, согласования естественных и производственных пищевых технологий, управления трофическими циклами в отдельных биоценозах и биосфере в целом как для защиты природы, так и для повышения пищевой продуктивности естественных и искусственных систем, создания эффективных и рациональных трофических связей в искусственных экосистемах и т. д.

Определенные перспективы намечены в направлении улучшения аминокислотного состава пищи путем введения в нее соответствующих пептидов вместо аминокислот. При этом, рядом исследователей (обзоры: Gardner, 1984, 1988) была показана высокая ценность белковых гидролизатов. Необходимо подчеркнуть, что при оптимизации питания возможно использование в рационах высокобелковых добавок, которые являются отходами различных пищевых производств, продуктов микробиального синтеза (Долганова, 1997; Студенцо-ва, 1996; Biotechnology., 1989 и др.). При этом диеты могут обогащаться микроэлементами, витаминами и т. д. Обоснованность применения подобного рода компонентов в составе рационов вытекает из положения о существовании общих закономерностей строения и функционирования систем, обеспечивающих ассимиляцию пищи всеми без исключения группами организмов, в том числе и рыбами.

В настоящее время создано достаточно много рационов для индустриального выращивания рыбы, в состав которых введены те или иные добавки. Однако следует отметить, что закономерности адаптационных процессов мембранного пищеварения, обеспечивающего расщепление более 80% химических связей, в ответ на введение отдельных компонентов в рационы холоднокровных животных исследованы слабо, а данные о наличии статистических связей различных цепей гидролиза практически отсутствуют.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлось изучение адаптационных процессов пищеварительной функции у рыб к изменению характера субстратной нагрузкии и особенностей мембранного пищеварения карпа Cyprinus carpio (L) и серебряного карася Carassius auratus (L.) в искусственно созданных экосистемах.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1.Изучить динамику активности ряда пищеварительных ферментов, осуществляющих гидролиз углеводной и белковой составляющих рациона карпа при частичной замене рыбной муки на белок микробиального происхождения.

2.Исследовать видовые особенности характера изменений активности кишечных ферментов карпа и серебряного карася при использовании в рационах в качестве добавки высушенного препарата спирулины (Spirulina) в различных концентрациях.

3.Изучить особенности адаптации пищеварительной функции карпа при использовании в качестве добавки в рационе отходов рыбопереработки — под-прессового бульона, высушенного на различных типах носителей.

4.Охарактеризовать влияние изменения состава рациона и ряда экологических факторов на линейно-весовые показатели и активность пищеварительных ферментов кишечника карпа и карася.

5.Исследовать статистические связи показателей, характеризующих пищеварение у рыб, при использовании различных добавок к рационам в условиях искусственно созданных экосистем.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведено комплексное исследование изменения активности пищеварительных ферментов карпа, осуществляющих расщепление углеводной и белковой составляющих рациона при изменении характера субстратной нагрузки при одновременном изучении кормовой базы, гидрохимических и гидрологических параметров, определяющих питание рыб. Установлен характер влияния концентрации йод-белкового препарата в рационе на интенсивность ферментативного расщепления компонентов пищи в кишечнике карпа. Выявлено наличие существенных статистических связей между скоростью гидролиза пищи у изучаемых рыб и показателями факторов среды.

Базируясь на результатах исследования статистической модели показана возможность эффективного использования высокобелковых водорослевых препаратов в качестве добавок к рационам различных объектов рыборазведения. Отмечены видовые особенности гидролитического расщепления спирули-ны в кишечнике карпа и серебряного карася. Впервые осуществлены эксперименты по использованию подпрессовых бульонов на различных носителях, в качестве добавок к комбикормам, используемым в рыбоводстве. Результаты позволили определить не только оптимальный тип носителя для бульона, но и выявить особенности реализации гидролитической функции и линейно-весовых изменений кишечного тракта у карпа при содержании на таких рационах.

Результаты диссертации представляют значительный практический интерес. В работе намечены пути рационального использования отходов рыбопереработки и продуктов микробиального синтеза приведены конкретные результаты, которые могут быть использованы в практике кормопроизводства и при кормлении рыбы в индустриальных условиях. Предложены рекомендации по применению в рыбоводстве в качестве добавки к корму подпрессового бульона на основе рисовой шелухи. Полученные регрессионные модели могут быть использованы в практических целях для прогнозирования активности нейтральной протеазы в кишечнике сеголеток карпа. Кроме того, наличие статистических моделей дает возможность в некоторых случаях без применения трудоемких методик определить значение того или иного показателя, используя данные о других факторах, получение которых не связано с проведением лабораторных экспериментов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Адаптация пищеварительной функции карповых рыб, содержащихся на рационах, в состав которых входят продукты микро-биального синтеза.

2. Приспособительные реакции ферментов карбогидразной и про-теазной цепей гидролиза на изменение компонентного состава рациона. ^.

3. Видовые особенностей/изменения морфо-функциональных показателей пищеварительной системы карася и карпа при введении в рацион белка растительного происхождения и продуктов рыбопереработки.

4. Моделирование" адаптационных изменений пищеварительной системы рыб при изменении субстратной нагрузки.

Автор выражает свою сердечную благодарность своему руководителю Заслуженному деятелю науки РФ, доктору сельскохозяйственных наук, профессору Зайцеву Вячеславу Федоровичу за научное руководство, постоянное внимание и помощь при выполнении работы, а также доктору биологических наук, профессору Неваленному Александру Николаевичу и кандидату биологических наук Егорову Сергею Николаевичу за ценные замечания, высказанные в процессе написания диссертации.

ВЫВОДЫ.

1. Пищеварительная функция сеголеток карпа, содержащихся на рационах, в состав которых входят продукты микробиального синтеза и концентрат микроэлементов, проявляет способность адаптироваться в ответ на изменение характера субстратной нагрузки. При этом активность пищеварительных ферментов углеводной и протеазной цепей гидролиза в большей степени определяется составом пищи.

2. Кишечные протеазы более лабильны в отношении качественного изменения состава рациона, в отличие от ферментов карбогидразного пула. Последним отводится ведущая роль в процессах ферментативных перестроек. Кроме того, на скорость гидролиза белковых пищевых компонентов в слизистой оболочке кишечника карпа существенное влияние оказывает показатель биомассы зоопланктона, что наглядно демонстрируют разработанные статистические модели.

3. Характер изменения динамики активности пищеварительных ферментов карбогидразной цепи определяется наличием «существенных» и «несущественных» изменений состава рациона. К «несущественным» изменениям рациона относятся компонентные замены, не приводящие к смещению рецептурного баланса веществ. При этом наблюдается адаптивная реакция пищеварительной функции, выраженная в изменении характера динамики общей амилолитической активности.

4. Существуют видовые особенности в способности гидролитической системы сеголеток карася и карпа адекватно реагировать на изменения композиционного состава рациона, выражающиеся в различном характере изменения скорости гидролиза белковых и углеводных компонентов пищи.

5. Переход от состояния голодания к питанию на первом этапе сопровождается у карпа структурными перестройками кишечника, дли.

156 тельное использование различных рационов приводит к адаптивным перестройкам функций пищеварительной системы, выраженным в усилении взаимообусловленности активности ферментов морфологическими показателями кишечника. При этом интенсивность адаптационных процессов существенно зависит от состава потребляемого корма.

6.

Введение

в состав рациона в качестве добавок подпрессового бульона, высушенного на различных носителях, вызывает адаптивные перестройки функции пищеварительных гидролаз, сопровождающиеся морфологическими изменениями, выраженными в увеличении массы слизистой оболочки кишечника, что является наглядной иллюстрацией принципа единства структуры и функции. Носители подпрессо-вых бульонов способны вызывать как существенный ингибирующий эффект на активность исследованных ферментов, так и не оказывать отрицательного влияния на реализацию гидролитической функции кишечника сеголеток карпа.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Как известно, собственно питание базируется на двух фундаментальных принципах — принципе универсальности строительных блоков и принципе универсальности функциональных блоков (обзоры: Уголев, 1983, 1985, 1987а, 1989, 1990). Причем, это относится как к экзотрофииутилизации пищевых веществ, поступающих из окружающей среды, так и к эндотрофии — утилизации веществ, содержавшихся в депо или структурах различных клеток, т. е. к использованию внутренних ресурсов организма. Оба типа депонирования слагаются из двух фундаментальных этапа. Первый — собственно пищеварение, или деполимеризация пищевых веществ, когда разрушаются крупные молекулы и надмолекулярные агрегации пищи и образуются транспортируемые и метаболизируемые формы. Второй — транспорт этих веществ, а также других, поступающих во внутреннюю среду организма без предварительной обработки в пищеварительной системе или в отдельных клетках. Все разнообразие процессов деполимеризации пищи у всех живых организмов — от бактерий до млекопитающих, как стало известно в конце 50-х годов, сводится к трем основным типам пищеварения: внеклеточному, внутриклеточному и мембранному (Уголев, 1963, 1967, 1972, 1985; Мембранный гидролиз., 1986; Membrane digestion., 1989).

Мембранное пищеварение происходит на границе внеклеточной и внутриклеточной сред и обладает некоторыми особенностями как внеклеточного, так и внутриклеточного пищеварения (Уголев, 1960, 1963, 1965, 1967; Уголев, Иезуитова, 1985; Ugolev, Iezuitova, 1982 и др.) Этот тип пищеварения обнаружен у всех организмов. Его особенность заключается в том, что оно малоэффективно по отношению к крупным молекулам и тем более надмолекулярным агрегатам (Мембранный гидролиз и транспорт, 1986; Уголев, 1972а, 19 726, 1985; Уголев и др.1979; Уголев, Иезуитова, 1985 и мн. др.). Мембранное пищеварение также интегрировано с процессами полостного пищеварения и всасывания. В настоящее время этот тип пищеварения описан у большого числа видов рыб, относящихся к различным семействам (Берман, 1964, 1965, 1968, 1972, 1976, 1979; Кушак, 1967, 1968, 1969; Пегель, Реморов, 1967; Пегель и др., 1971; Пегель, Антипин, 1972, 1973, 1976; Кузьмина, 1976, 1977, 1978, 1979, 1981, 1984 и мн. другие). Приведенные данные свидетельствуют о том, что рыбы обладают как структурами, необходимыми для протекания процессов мембранного пищеварения, так и набором ферментов, осуществляющих мембранный гидролиз пищи.

Как известно, углеводы при своей дешевизне и доступности являются эффективным источником энергии для многих видов рыб. Углеводный обмен у разных видов рыб протекает по-разному (Щербина, Казлаускене, 1972). У карпа расщепление и всасывание клетчатки происходит более интенсивно. При этом в кормах, богатых легкоперевариваемыми гидроли-зуемыми углеводами, перевариваемость ее мала, а в кормах с низким содержанием гидролизуемых углеводов, особенно в случае жмыхов и шротов, клетчатка переваривается довольно интенсивно (Гамыгин, 1987). В комбикормах применяемых при выращивании карпа в прудовых условиях до 70% их состава приходится на компоненты растительного происхождения. Кроме того, существенную долю рациона карпа может составлять детрит.

Следует напомнить, что адаптация живых организмов к постоянно меняющимся условиям внешней среды, относится к основным биологическим свойствам, которые проявляются на всех уровнях организации жизни I и пищеварительная система в этом отношении не является исключением. В наших экспериментах показано, что гидролиз углеводных компонентов в кишечнике у сеголеток карпа может обуславливаться факторами различной природы, к которым можно отнести возрастные и видовые особенности пищеварительной системы рыб, факторы абиотической природы и т. д.

Дефицит кормов животного происхождения вызвал необходимость включения в традиционные корма продуктов микробиологического синтеза. При этом работы проводились в дух направлениях — частичной замены компонентов животного происхождения в рационах (Alroy, Tannenbaum, 1973; Рядчиков, 1963, 1971, 1978; Вальдман, Бекер, 1965; Мирошниченко, 1980; Остроумова, Абрамова, 1981; Скляров и др., 1985, 1986; Дума, Щербина, 1988; Сазонов и др., 1988 и мн. др.), а также полной их замены (Скляров, 1982; Скляров и др., 1984).

Особое место в наших экспериментах занимает наблюдаемая адаптация гидролитической функции к составу рациона во времени. Так, анализируя полученные результаты, необходимо обратить внимание на то, что в начальный период кормления активность комплекса карбогидраз слизистой оболочки кишечника у сеголеток карпа, потреблявших 3 вариант корма, практически не отличалась от таковой, выявленной у рыб, выращиваемых на контрольном корме. У карпа, содержавшегося на 1 и 2 вариантах корма, общая амилолитическая активность была достоверно выше. К началу основного периода кормления отмечалось возрастание уровня общей амилолитической активности в слизистой оболочке кишечника карпа, получавшего контрольный рацион и 1 вариант корма, тогда у рыб, потреблявших 2 вариант корма, наблюдалось снижение активности комплекса кишечных карбогидраз. Последующее снижение суммарной карбо-гидразной активности отмечено у карпа из всех экспериментальных прудов, однако, экстремальные значения были зафиксированы в различные моменты сезона выращивания. В конце сезона выращивания общая амилолитическая активность слизистой оболочки кишечника карпа, выращиваемого с применением контрольного корма, 1 и 2 вариантов корма, находилась на одном уровне, а у рыб, потреблявших 3 вариант корма, была на 15% выше.

Особо следует отметить, что суммарная карбогидразная активность кишечной слизистой карпа на протяжении основного периода выращивания с использованием контрольного корма была достоверно выше, а при содержании на 2 вариантом корма — достоверно ниже по сравнению с исследуемым показателем у рыб из других экспериментальных прудов.

В литературе есть сведения о том, что гидролазы, функционирующие в просвете кишечника и его слизистой оболочке должны находиться в тесном сопряжении (Груздков и др., 1986). Полученные нами данные корреляционного анализа свидетельствуют о довольно тесной связи общей амилолитической активности как с панкреатической а-амилазой, адсорбированной на слизистой оболочке кишечника карпа, так и собственно кишечной мальтазой у карпа, выращиваемого на контрольном варианте корма.

Необходимо особо отметить, что при выращивании сеголеток карпа с использованием 1 экспериментального корма не удалось выявить корреляционных связей между показателем общей амилолитической активности и активностью других исследуемых ферментов карбогидразной цепи.

Нами показано, что характер роли выявленных главных факторов, формирующих показатель активности комплекса карбогидраз, существенным образом зависит от состава используемых кормов. Так, при кормлении рыб комбикормом, содержащим в своем составе 0.08 г/кг корма фи-лофорового шрота вклад а-амилазы характеризуется как положительный, для мальтазы подобная картина выявлена при применении 4 варианта корма.

Как отмечено в ряде работ (Уголев, Кассиль, 1961, 1972; Кассиль и др. 1970; Уголев, 1978, и др.), существуют специфические особенности морфологических, физиологических и биохимических приспособлений пищеварительной системы и ее ферментного спектра. Сопоставляя характер изменений активности панкреатической а-амилазы, адсорбированной на слизистой оболочке кишечника сеголеток карпа на протяжении сезона выращивания можно отметить, что максимальные значения исследуемого показателя у рыб из всех экспериментальных прудов были характерны для начального периода кормления. Далее наблюдалось статистически значимое снижение уровня активности а-амилазы у рыб из всех экспериментальных прудов. На протяжении остального периода выращивания отмечалась устойчивая тенденция к возрастанию активности а-амилазы.

Таким образом, характерной особенностью изменения активности ос-амилазы слизистой оболочки кишечника карпа на протяжении сезона выращивания являлось наличие более или менее четко выраженного минимума в середине основного периода кормления, исключение составляли особи, содержавшиеся на контрольном корме, у которых минимум исследуемого показателя был отмечен в начале основного периода кормления. При этом необходимо подчеркнуть, что как в начале эксперимента, так и по его окончании активность а-амилазы в слизистой оболочке кишечника карпа из разных экспериментальных прудов различалась слабо.

Как было отмечено нами ранее, показатель общей амилолитической активности зависит от уровня активности как полостных, так и собственно кишечных ферментов, осуществляющих гидролиз углеводных компонентов пищи в кишечнике рыб. Наибольшей вариабельностью активности при изменении состава рациона характеризуются панкреатические ферменты, участвующие в начальных стадиях гидролиза полисахаридов. При этом а-амилаза, являясь полостным ферментом, находится во взаимодействии как с собственно кишечными ферментами, участвующими в заключительных этапах расщепления углеводных компонентов пищи, так и с показателями, определяющими процесс ее потребления. Это наглядно иллюстрируют данные проведенного нами корреляционного анализа.

Найденные в результате пошагового регрессионного анализа «главные» показатели — активность мальтазы, нейтральной протеазы, биомасса зоопланктона, определяющие значение активности а-амилазы в кишечнике карпа из контрольной группы подтверждают результаты корреляционного анализа.

Интересен тот факт, что для адсорбированной а-амилазы кишечника карпа, получавшего 3 вариант корма, не удалось выявить факторы, которые играли бы значительную роль в формировании ее показателя активности.

Анализ изменения активности кишечной мальтазы у сеголеток карпа позволяет утверждать, что тенденции изменения исследуемого показателя на протяжении сезона выращивания аналогичны таковым, идентифицированным для а-амилазы, т. е. для карпа, из контрольной группы минимум зафиксирован в начале основного периода кормления, для рыб, выращиваемых на других вариантах корма — в середине основного периода кормления. Необходимо отметить, что выявленные тенденции изменения активности мальтазы менее четко выражены по сравнению с тенденциями изменения активности а-амилазы, кроме того, в начале и в конце эксперимента значения уровня активности мальтазы у рыб из разных экспериментальных прудов существенно различаются.

По нашему мнению, низкие значения коэффициента детерминации, полученные после проведения регрессионного анализа могут свидетельствовать о том, что активность мальтазы подвержена значительным изменениям, которые могут быть вызваны не только формирующими, но и множеством других «второстепенных» факторов, аддитивный эффект воздействия которых может быть весьма существенным. Это доказывают значения показателей остатков, полученных при проведении статистического анализа.

При анализе общей картины динамики активности исследуемых ферментов карбогидразной цепи, функционирующих в слизистой оболочке кишечника карпа, на протяжении сезона выращивания, нами была отмечена важная особенность, связанная с изменением состава корма. На примере общей амилолитической активности легко проследить, что любое композиционное изменение комбикорма относительно контроля приводит к перестройкам динамики активности фермента. При этом следует отметить, что чем значительнее изменение состава корма, тем более изменяется картина динамики активности, о чем свидетельствуют данные, полученные при исследовании карпа, содержавшегося на 2 и 3 вариантах кормов. Так, при использовании в комбикорме более высокой концентрации йод-белкового препарата (3 вариант корма), наблюдается иной характер динамики активности комплекса карбогидраз на протяжении периода кормления, нежели при использовании более низкой концентрации этой добавки (2 вариант корма).

На основании этого, по нашему мнению, изменения состава корма можно разделить на существенные и несущественные. Как показали результаты экспериментов, несущественным изменениям, по-видимому, соответствует вполне определенная характерная картина динамики общей амилолитической активности. На это указывают и данные, полученные при исследовании пищеварительной функции у карпа, содержавшегося на 4 варианте корма.

Учитывая тот факт, что общая амилолитическая активность является интегративным показателем, на который оказывают влияние как собственно кишечные, так и адсорбированные панкреатические ферменты, нами была предпринята попытка сопоставления динамик активности собственно кишечной мальтазы и адсорбированной на слизистой оболочке кишечника полостной а-амилазы с динамикой общей амилолитической активности на протяжении периода кормления.

Как показали наши результаты, предположение о возможности условного разделения изменений состава корма на существенные и несущественные, оказалось справедливым и в отношении адсорбированной панкреатической а-амилазы. Собственно кишечная мальтаза характеризовалась большей лабильностью, что связано с ее ролью, как фермента, участвующего в расщеплении мелких фрагментов полисахаридной цепи, образующихся в результате воздействия на субстрат полостных ферментов.

Одной из биологических особенностей рыб, с точки зрения питания, является потребность в большом количестве протеина. Значительная часть протеина пищи выполняет в организме рыб, помимо пластической, энергетическую функцию (Щербина и др., 1976, 1977). Как отмечают эти авторы, смеси протеинов разного происхождения усваиваются рыбами лучше, чем каждый в отдельности. В связи с этим было интересно сопоставить течение процессов гидролиза в кишечнике у карпа белковой составляющей различных комбикормов.

При анализе данных, полученные в результате исследования динамики активности нейтральной протеазы, функционирующей в слизистой оболочке кишечника сеголеток карпа, на протяжении сезона выращивания нами отмечена общность характера изменений активности нейтральной протеазы у сеголеток из контроля и получавших 1 вариант корма. Необходимо подчеркнуть, что в начальный период кормления активность нейтральной протеазы в слизистой оболочке кишечника карпа характеризовалась большей вариабельностью, чем в основной и заключительный периоды кормления, что может служить показателем стабилизации функции.

Следует также отметить, что изменения уровня активности нейтральной протеазы в слизистой оболочке кишечника карпа, выращиваемого на 2 варианте корма, существенно отличались от описанного выше. Кроме того, во всех контрольных точках уровень активности был ниже, чем одноименный показатель у карпа, содержавшегося на 1 варианте корма и на контрольном корме.

Для активности нейтральной протеазы, функционирующей в слизистой оболочке кишечника сеголеток карпа, выращиваемых с использованием 3 вариант корма, в начальный период кормления отмечена тенденция к снижению значений исследуемого показателя. Однако следует отметить, что уровень активности нейтральной протеазы при выращивании карпа на 3 варианте корма достоверно ниже в этот период, чем при использовании других вариантов корма. Ее минимум был отмечен в начале основного периода кормления. Далее до конца выращивания наблюдалось увеличение скорости гидролиза белковых компонентов пищи в кишечнике у карпа в этом пруду, при этом наиболее интенсивной рост уровня активности отмечен в заключительном периоде кормления.

По свидетельству ряда авторов, потребность рыб в протеине зависит в значительной мере от температуры воды (Гусевич, 1981; Егорова и др., 1974; Иванов, 1985; Коростелев и др., 1992; Неваленный и др., 1991). Нам, однако, не удалось установить наличие статистических связей активности кишечных протеаз с гидрохимическими показателями.

Как показали результаты пошагового регрессионного анализа, активность нейтральной протеазы слизистой кишечника карпа во всех экспериментальных прудах в значительной мере определялась такими показателями как активность адсорбированной на слизистой оболочке кишечника а-амилазы, активность щелочной протеазы и биомасса зоопланктона. Причем следует отметить положительный вклад биомассы зоопланктона как фактора, определяющего значение результирующего признака, которым является активность нейтральной протеазы, за исключением карпа из 3 опытного пруда. Необходимо обратить внимание, что это влияние в большей степени выражено у рыб из контрольной группы. Факт факторного влияния биомассы зоопланктона на активность нейтральной протеазы представляется нам весьма закономерным. Очевидно, что при неизменном составе комбикорма доля белка в поступающей пище может быть изменена непосредственно только за счет потребления кормовых организмов.

Как показали результаты статистического анализа при замене в комбикорме рыбной муки на паприн и увеличении концентрации йод-белкового препарата отмечается тенденция к возрастанию роли панкреатической а-амилазы в формировании значений активности нейтральной протеазы, тогда как уровень активности щелочной протеазы в большей степени оказывает воздействие на исследуемый показатель, при концентрации йод-белкового препарата 0.04 г/кг.

Таким образом, полученные регрессионные модели могут быть использованы в практических целях для прогнозирования активности нейтральной протеазы в кишечнике сеголеток карпа. Актуальность подобного прогнозирования продиктована важностью наблюдения за процессами потребления, гидролиза и утилизации компонентов пищи у молоди рыб при выращивании как на естественной кормовой базе, так и на искусственных кормах, в условиях воздействия всего комплекса экологических факторов среды. Кроме того, наличие статистических моделей дает возможность в некоторых случаях без применения трудоемких методик определить значение того или иного показателя, используя данные о других факторах, получение которых не связано с проведением лабораторных экспериментов.

Необходимо отметить, что характер динамики активности нейтральной и щелочной протеаз во многом сходен. Это касается и показателей размаха значений скорости гидролиза в контрольных точках и распределения уровня активности в этих точках на протяжении периода кормления. Различия в характере динамики отмечены нами только на протяжении основного периода кормления. Отсутствие желудка у карпа, как отмечалось выше, обусловливает особенности пищеварительной системы, которые выражаются в реализации гидролитических процессов в слабощелочной среде. Следует предположить, что при изменении состава корма, в частности количества и качества содержавшихся белков, наряду с активностью нейтральной протеазы будет меняться и активность щелочной протеазы.

Процедура пошагового регрессионного анализа показала, что уровень активности щелочной протеазы в слизистой оболочке кишечника карпа существенным образом определялся активностью нейтральной протеазы, при этом в некоторых случаях было отмечено возрастание роли биомассы зоопланктона в экспериментальных прудах при гидролизе белковых компонентов пищи в кишечном тракте у сеголеток. Нами отмечено, что влияние на формирование показателя активности щелочной протеазы у карпа из всех прудов оказывает ограниченное число факторов. При этом наблюдается снижение значений коэффициента детерминации. В подобных ситуациях в формировании значения признака увеличивается роль так называемых остатков — несущественных (второстепенных) факторов, доля которых в общем вкладе крайне мала, но эффект их суммарного воздействия может быть сравним с вкладом главных факторов. В качестве наглядной иллюстрации подобного факта может служить и уравнение регрессии, демонстрирующее форму связи активности щелочной протеазы с различными факторами, полученное для сеголеток карпа, выращиваемых на 1 варианте корма.

Как показали наши исследования, ферменты протеазной цепи являются более «консервативными» в отношении изменения состава комбикорма и на формирование показателя уровня протеолитической активности большое влияние оказывают ферменты карбогидразной цепи. Подобный факт отмечался и ранее в работах ряда авторов (Уголев, 1972; Груздков и др., 1985; Егоров, 1995).

Как известно, весь комплекс рыбоводных интенсификационных мероприятий направлен на достижение нормативных показателей, установленных для каждой зоны рыбоводства, в конце сезона выращивания. Анализируя рыбоводные результаты выращивания молоди карпа во всех экспериментальных прудах можно отметить разницу итоговых показателей. Так наименьший выход сеголетков был зарегистрирован в пруду, где использовался контрольный вариант корма. Тогда как в других прудах этот показатель был в 1.7 раза выше. Максимальная средняя масса была отмечена нами у карпа при содержании на 3 варианте корма, в этом же пруду наблюдалась и максимальная рыбопродуктивность. Необходимо при этом подчеркнуть, что затраты корма по карпу во всех экспериментальных прудах различались слабо.

Таким образом, результаты, полученные нами при выращивании сеголеток карпа в прудах с использованием комбикормов, в состав которых входили продукты микробиального синтеза и концентрат микроэлементов, позволили заключить, что пищеварительная функция способна адаптироваться в ответ на введение в корм подобного рода добавок. Активность пищеварительных ферментов углеводной и протеазной цепей гидролиза в большей степени определяется составом пищи, который обуславливает наличие статистических связей между энзимами. При этом кишечные про-теазы более лабильны в отношении качественного изменения состава комбикорма нежели ферменты карбогидразного пула. Последним отводится ведущая роль в процессах ферментативных перестроек. Кроме того, на скорость гидролиза белковых пищевых компонентов в слизистой оболочке кишечника карпа может оказывать влияние показатель биомассы зоопланктона в прудах.

Нами, на примере динамики активности пищеварительных ферментов карбогидразной цепи — общей амилолитической активности и активности адсорбированной на слизистой оболочке кишечника панкреатической а-амилазы, показано наличие «существенных» и «несущественных» изменений состава комбикорма. Эти данные могут быть использованы в качестве тестовых в практике разработки новых рецептур комбикормов.

Учитывая результаты анализа активности ферментов у карпа на протяжении сезона выращивания, данные статистической обработки результатов и полученные в конце сезона рыбоводные показатели, мы полагаем, что наиболее эффективным во всех отношениях является корм, в состав которого входил концентрат микроэлементов (Приложение 1).

Как известно, сине-зеленая водоросль Spirulina platensis привлекает большое внимание как объект промышленного фототрофного биосинтеза белково-витаминных кормовых и пищевых продуктов. (Пиневич и др., 1970; Clement, Landegen, 1970; Hedenskog, Hoisten, 1970; Wouters, 1969). Однако отмечается, что у разных видов животных переваримость этой водоросли неодинакова. При этом все авторы утверждают, что водорослевая мука в рационе рыб повышает уровень обменных процессов, стимулирует рост рыб и эффективность использования комбикормов. Указывается, что питательная ее ценность определяется, кроме того, содержанием углеводов и белков. Данные о влиянии введения спирулины в состав комбикормов на морфологические и физиологические показатели кишечника рыб в литературе нами не обнаружены. На основании этого была осуществлена серия комплексных аквариальных экспериментов на сеголетках карпа и карася, призванная восполнить этот пробел.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что относительная масса мышечной оболочки кишечника в опытных группах карпа и карася превосходит таковую, описанную для контроля. При этом, относительная масса слизистой кишечника у сеголеток карася из опытной группы выше, чем у рыб контрольной группы. Следует обратить особое внимание на то, что у сеголеток карпа относительная масса слизистой оболочки кишечника в контроле выше, чем в опыте.

По нашему мнению закономерным является тот факт, что относительная масса слизистой оболочки кишечника как в опытной, так и в контрольной группе, у карпа в 5.4 раза выше, чем у карася. По нашему мнению это обусловлено разницей такого морфометрического показателя как длина кишечника у карпа и карася, так как распределение массы слизистой оболочки на единицу длины у обоих видов рыб аналогично.

Как известно, принцип единства структуры и функции подразумевает наличие связи между структурными особенностями той или иной системы и ее функциональным состоянием (Уголев, 1985; Уголев и др., 1986; Физиология адаптационных процессов, 1986; ВиёсИг^оп, БогобЬоу, 1986), поэтому нами также была исследована активность ферментов, функционирующих в слизистой оболочке кишечника рыб.

Анализ полученных данных, характеризующих активность комплекса карбогидраз и нейтральной протеазы слизистой кишечника сеголеток карпа и карася, позволил выявить целый ряд интересных, на наш взгляд, моментов. Высокий уровень суммарной карбогидразной активности, отмеченный в слизистой оболочке кишечника карася, свидетельствует о том, что гидролитическая система кишечника этой рыбы способна эффективно расщеплять клеточную оболочку спирулины, большую часть которой составляют углеводные компоненты. В пользу этого предположения говорят данные, приводимые другими авторами об обусловленности уровня активности фермента количеством субстрата, который он расщепляет (Груздков, 1986, 1991; Кушак, 1983). Кроме того, следует обратить внимание на тот факт, что аналогичная картина отмечена и для нейтральной протеазной активности слизистой кишечника сеголеток карася. Высокая скорость гидролиза белковых компонентов рациона, отмеченная нами в опытной группе карася свидетельствует о способности пищеварительной системы успешно гидролизовать содержимое клетки водоросли спирулины, большей частью представленное полипептидами.

Ранее было продемонстрировано существование интегративных адаптивных перестроек ферментов, осуществляющих полостное и мембранное пищеварение у млекопитающих, в зависимости от композиции пищи (Уголев и др., 1978). При этом было отмечено, что на фоне белковой диеты наиболее мощной становится пептид-гидролазная ферментная цепь, на фоне жировой — липазная и на фоне углеводной — карбогидразная. Сравнивая уровни активности исследуемых ферментов в опытных группах карася и карпа нами идентифицирована слабая выраженность реакции гидролитической функции у последнего на введение в рацион спирулины.

Сопоставление результатов морфологического и функционального анализа кишечного тракта, проведенного в контрольной и опытной группах двух видов рыб, позволило сделать заключение о том, что функциональные перестройки пищеварительной системы сопровождаются некоторыми структурными изменениями мышечной и слизистой оболочек кишечника. Что выражается как в изменении скорости гидролиза компонентов пищи, так и изменении массы мышечной и слизистой оболочек.

Как известно, состояние гидролитической функции пищеварительной системы характеризуется не только абсолютными значениями активности ферментов, но и их топографией, которую демонстрируют прокси-мо-дистальные градиенты активности ферментов, функционирующих в слизистой оболочке кишечника рыб.

Данные, полученные нами для сеголетков карася, свидетельствуют о том, что, достоверные различия активности комплекса карбогидраз во всех отделах кишечника контрольной группы рыб и рыб, содержавшихся на 2 варианте корма, отсутствуют. У сеголеток карася, содержавшихся на 1 варианте корма, максимум активности комплекса карбогидраз отмечен в дистальном отделе, при этом различия в проксимальном и медиальном отделах отсутствовали и были в 1.6 раза ниже, чем в дистальном.

Данные, полученные при использовании контрольного корма, позволяют констатировать более высокую активность нейтральной протеазы в проксимальном отделе по сравнению с медиальным и дистальным, при этом в двух последних отделах различий не отмечено. При содержании карася на 1 и 2 вариантах корма, напротив, различия отсутствовали в проксимальном и медиальном отделах, тогда как дистальный отдел в обоих вариантах отличался более высокой нейтральнопротеазной активностью.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что введение в состав рациона дополнительного количества белка в большей степени оказало воздействие на ферментативные перестройки цепи, осуществляющей расщепление белковой составляющей корма, что отчетливо выражено в изменении характера проксимо-дистальных градиентов нейтральнопротеазной активности.

У большинства организмов можно выделить состояние голода, при котором используются эндогенные пищевые ресурсы (эндотрофия), и состояние сытости после потребления экзогенных пищевых веществ (экзо-трофия). Реальный процесс насыщения зависит не только от поступления в организм пищевых веществ, но и от регуляции метаболических процессов. В последнем случае под влиянием нервных и химических сигналов меняются как уровень, так и характер обмена Таким образом, ассимиляция пищи связана с поступлением во внутреннюю среду организма не только пищевых веществ, но и трофических регуляторных сигналов. Этим вопросам посвящены фундаментальные обзоры о регуляции выбора и потребления пищи, а также взаимоотношениях этих процессов с обменом веществ (Handbook., 1967; Асатиани, Бакурадзе, 1974; Booth, 1974; Slanger, 1974; Lepkovsky, 1975; Hunger., 1976; Committee., 1980; Management., 1985; Morley et al., 1985; Fisler, 1987; Замбржицкий, 1989; The physiology., 1989; Кассиль, 1990; Green et al., 1990, и др.), а также в специальных сводках (Уголев, Кассиль, 1961, 1972; Кассиль и др. 1970; Уголев, 1978, и др.). По свидетельству ряда авторов для адаптации пищеварительной функции к композиционному составу пищи необходимо некоторое время. (Уголев, Кузьмина, 1988; Кушак, 1983; Неваленный и др., 1989). В связи с этим особый интерес представляло исследование динамики параметров, характеризующих адаптацию гидролитической функции и морфологии кишечника, связанную с введением в рацион спирулины.

Важно отметить, что при исследовании изменения уровня активности нейтральной протеазы, осуществляющей мембранный гидролиз белковых компонентов пищи в кишечнике сеголеток карпа не было отмечено достоверных различий в контроле и опыте на протяжении всего эксперимента. Это еще раз свидетельствует о лабильности протеазной гидролитической цепи к изменению белковой составляющей корма.

Изменение уровня суммарной карбогидразной активности как в опыте, так и в контроле, имеет сходный характер. Однако, при этом численные значения активности фермента у опытной и контрольной групп достоверно различаются как через неделю, так и через семь недель после начала кормления.

Как свидетельствуют результаты статистического анализа, на рост относительной массы слизистой оболочки кишечника сеголеток карпа на протяжении всего эксперимента не оказывали влияния колебания относительной массы мышечной оболочки кишечника, что свидетельствует о буферной роли гликокаликса в структурно-функциональной организации кишечника.

В связи с этим особый интерес представляло наблюдение развития взаимообусловленности массы мышечной и слизистой оболочек кишечника, а также активности комплекса карбогидраз и нейтральной протеазы, функционирующих в гликокаликсе кишечника рыб. Нами для состояния голодания были установлены единичные случаи выявления корреляционных связей. Через 1 неделю после начала кормления характер взаимообусловленностей существенно изменился. Как в контроле, так и в опыте были выявлены корреляционные связи между показателями, характеризующими морфологию кишечника. Особое внимание следует обратить на то, что сила корреляционных связей между наблюдаемыми показателями у контрольной группы рыб была значительно выше, чем у рыб из опытной группы. Длительное использование искусственных кормов привело организм рыб к необходимости адаптации пищеварительной функции к конкретному рациону, что нашло свое отражение в данных, полученных в результате корреляционного анализа, проведенного через 7 недель кормления. Нами был отмечен важный факт появления статистических связей, характеризующих гидролитическую функцию кишечника как в опыте, так и в контроле.

Анализируя данные, полученные в результате корреляционного анализа, следует отметить, что переход от состояния голодания к питанию на первом этапе сопровождается структурными перестройками кишечника, что ярко иллюстрируют выявленные через одну неделю кормления корреляционные связи. Длительное использование различных рационов вслед за этим приводит к адаптивным перестройкам функций пищеварительной системы, выраженным в усилении взаимообусловленности активности ферментов морфологическими показателями кишечника и наоборот. При этом интенсивность адаптационных процессов существенно зависит от состава потребляемого корма, что, как показывают наши данные, можно отметить даже за короткий промежуток кормления различными диетами.

В последние годы наметилась тенденция к использованию в качестве источника белка отходов различных производств. Рыбная промышленность здесь не является исключением. Подпрессовые бульоны, образующиеся при получении рыбной кормовой муки, содержат значительное количество азотистых веществ, а также жир и минеральные вещества. Для повышения массовой доли плотных веществ в продукте в качестве наполнителей для сушки подпрессовых бульонов и гидролизатов из него была предпринята попытка использования рисовой шелухи и килечной чешуи после снятия гуанина. Анализ результатов работ показал, что оба этих наполнителя можно использовать для сушки бульона (Виннов, Долганова,.

1988; Виннов и др., 1993). Исследования также показали, что возможно многократное использование одного и того же наполнителя (Долганова, 1997). Нами были проведены исследования процессов адаптации пищеварительной функции к изменению состава рациона при использовании в качестве добавок к комбикорму подпрессового бульона, высушенного на различных носителях.

Известно, что на протяжении всей жизни животного существует субстратный контроль ферментов, расщепляющих пищевые вещества в зоне мембранного пищеварения (Уголев, 1972). Как правило, ферментные адаптации являются субстратноспецифичными. Увеличение доли какого-либо субстрата сопровождается индукцией активности соответствующего фермента, а уменьшение содержания субстрата в пище приводит к репрессии активности, что связано с процессами синтеза и деградации данного фермента. В литературе есть сведения о наличии адаптаций спектра ферментов, осуществляющих мембранный гидролиз, к типу питания. Ранее была установлена способность пищеварительной функции кишечника адаптироваться к изменению состава потребляемой пищи (обзор: Уголев, 1972; Мембранный гидролиз и транспорт, 1986). Об этом, в частности, свидетельствуют данные о повышении или снижении уровня ряда ферментных активностей кишечника при изменении в диете доли соответствующих субстратов. Анализ полученных нами результатов хорошо согласуется с результатами, приводимыми другими авторами (Кузьмина, 1987; Кушак, 1983; Мембранный гидролиз и транспорт, 1986; Уголев, 1972; Уголев и др., 1974). Так, при введении в рацион карпа в качестве добавки подпрессового бульона, высушенного на рисовой шелухе, увеличивается доля белковой составляющей пищи, что приводит к увеличению скорости гидролиза белковых компонентов. При этом, следует отметить, что являясь трудногидролизуемой, рисовая шелуха не оказывает существенного влияния на гидролиз углеводных компонентов пищи. Необходимо обратить внимание на следующий факт внимание на следующий факт — использование в качестве добавки к корму подпрессового бульона, высушенного на рисовой шелухе и чешуе кильки приводит к существенному снижению активности исследуемых ферментов. По нашему мнению, это вызвано введением в состав добавки чешуи кильки. Как показали результаты эксперимента, использование этого носителя оказывало сильный ингибирующий эффект на гидролиз белковых и углеводных компонентов корма, что подтверждается рассчитанными значениями тотальной активности.

Таким образом, введение в состав комбикорма в качестве добавок подпрессового бульона, высушенного на различных носителях, вызывает ответную реакцию пищеварительной системы сеголетков карпа, выраженную в адаптивных перестройках ее гидролаз. Использование в добавках к комбикормам в качестве носителя рисовой шелухи и чешуи кильки приводит к ярко выраженному ингибирующему эффекту активности исследованных ферментов, обусловленному введением в состав носителя чешуи кильки. Этот факт подтверждается результатами проведенных нами ранее экспериментов с опытным кормом, где в качестве добавки использовали подпрессовый бульон, высушенный только на основе чешуи кильки (10:1). Функциональные перестройки пищеварительной системы сеголеток карпа сопровождаются морфологическими изменениями, выраженными в увеличении массы слизистой оболочки кишечника, что является наглядной иллюстрацией принципа единства структуры и функции, выдвинутого и обоснованного ранее рядом авторов (Уголев, 1985; Уголев и др., 1986; Физиология адаптационных процессов, 1986; ВискПп§ 1-оп, ОогобЬоу, 1986).

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что использование в качестве добавки к корму подпрессового бульона на основе рисовой шелухи в соотношении 8:1 не оказывает отрицательного влияния на реализацию гидролитической функции кишечника сеголеток карпа, что позволяет рекомендовать эту добавку к применению в рыбоводстве.

Таким образом, одной из важных задач является понимание физиологических потребностей живого организма в питании в разных экологических условиях. Такое понимание может быть достигнуто на основе системы фундаментальных и прикладных исследований. В настоящее время организация рационального питания для культивируемых человеком живых организмов является компромиссом между ограниченным возможностями в снабжении пищей и теоретически обоснованным оптимальным питанием. Чаще всего в основе компромисса лежит нехватка ряда пищевых компонентов рациона или их высокая стоимость. В первую очередь это касается белка. Белковый рацион может быть оптимизирован за счет сочетания белковой пищи с другими продуктами, которые сберегают расход белка, а также обогащают его. При оптимизации питания необходимо также учитывать пищевые добавки, которые находят все большее применение в питании человека и особенно сельскохозяйственных животных. Проведенные нами исследования позволяют несколько глубже проникнуть в сущность этой важной проблемы. Тем не менее, возможны оптимальные сочетания пищевых продуктов применительно к конкретным условиям питания и дальнейшие поиски в этом направлении.