Генотипы штаммов Yersinia pseudotuberculosis и их клиническое и диагностическое значение

Актуальность темы

исследования.

Псевдотуберкулез остается актуальной проблемой здравоохранения в России и во многих странах мира. Заболевание отличают выраженный полиморфизм клинических проявлений, отсуствие четких патогномоничных симптомов, склонность к затяжному и хроническому течению. Между тем причины, обуславливающие данное многообразие и сложность патогенеза остаются невыясненными.

Инфекционный процесс представляет собой ограниченное во времени сложное взаимодействие биологических систем микроорганизма и макроорганизма, протекающее в определенных условиях внешней среды. В этой связи чрезвычайно актуально изучение роли генетических детерминант вирулентности бактерий Y. pseudotuberculosis и влияния их продуктов на течение инфекционного процесса, территориальное распространение болезни.

В отдельных работах предприняты попытки объяснить разнообразие клинических форм псевдотуберкулеза за счет наличия у возбудителя тех или иных детерминант вирулентности (Fukushima Н. et al., 2001; Carniel Е., 2001; Mollaret Н., 1990; Чеснокова М. В. и соавт., 2006). В то же время среди популяции возбудителя псевдотуберкулеза выявлены особенности циркуляции штаммов Y. pseudotuberculosis, содержащих уршА или «остров» высокой па-тогенности, связанные с географическими регионами (Fukushima Н. et al., 2001). Основные клинические симптомы инфекции, вызванной Y. pseudotuberculosis в России, Японии и Южной Корее разнообразнее и тяжелее, чем на Европейских территориях и характеризуются системными проявлениями болезни. Типичный для России симптомокомплекс псевдотуберкулеза получил название — дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка (ДСЛ).

Открытие способности к синтезу суперантигена и установление его роли в патогенезе инфекции позволили пересмотреть механизм появления некоторых симптомов при псевдотуберкулезе. В настоящее время с продукцией Y. pseudotuberculosis суперантигена YPMa связывают такие иммунопатологические осложнения псевдотуберкулеза, как реактивный артрит, синдром Рейтера, острый увеит и синдром Кавасаки (Sato К. et al., 1983; Treacher D. et al, 1986; BabaK. et al., 1991).

Хорошо изучен «остров» высокой патогенности Y. pseudotuberculosis, ответственный за биосинтез и регуляцию системы утилизации железа. Считают, что он необходим для проявления высоковирулентного фенотипа возбудителя (Carniel Е., 2001).

Особый интерес представляет плазмида с молекулярной массой 82 МДа (pVM82), обнаруживаемая до настоящего времени у штаммов Y. pseudotuberculosis серотипа О: lb только в России, и не встречающаяся у других представителей рода Yersinia. Доказано, что наличие плазмиды pVM82 у возбудителя способствует более тяжелому течению инфекции (Шу-рыгина И.А., 2007). Однако, ее нуклеотидная последовательность до настоящего времени не расшифрована, равно как не исследовано её наличие у штаммов Y. pseudotuberculosis, циркулирующих в различных регионах мира.

Учитывая многообразие вариантов течения болезни, обусловленного различиями в патогенных свойствах возбудителя псевдотуберкулеза, для клинической практики актуально, прежде всего, изучение биологических характеристик штаммов Y. pseudotuberculosis циркулирующих на различных территориях. Вместе с тем для оптимизации мониторинга за возбудителем, а также выбора тактики обследования больных требуются наиболее полные знания о влиянии возбудителя псевдотуберкулеза с различным набором генетических детерминант вирулентности на особенности течения инфекции и совершенствование специфической диагностики заболевания.

Ограниченные возможности распознавания случаев заболевания иер-синиозами, в частности псевдотуберкулеза, на поздних сроках приводят к гиподиагностике, развитию хронических форм (до 30% случаев) и осложнений. Это обуславливает необходимость поиска новых, более чувствительных методов этиологической диагностики заболевания.

В связи с изложенным, представлялось актуальным изучение генетических характеристик штаммов возбудителя псевдотуберкулеза и разработка набора для серологической диагностики иерсиниозов.

Степень разработанности темы исследования.

Клинические особенности проявлений псевдотуберкулеза в различных регионах мира. Роль отдельных факторов вирулентности в инфекционном процессе.

Псевдотуберкулез, вызываемый Y. pseudotuberculosis, поражает человека и многие виды диких и сельскохозяйственных животных. Это заболевание широко распространено в мире, но более характерно для стран с холодным климатом. В России, Китае, Японии и Корее заболеваемость носит эпидемический и спорадический характер и регистрируется на высоком уровне, клинические проявления тяжелее, чем на американских и австралийском континентах, скандинавских и европейских странах, ряде южноазиатских стран, где заболевания чаще носят спорадический характер, а клинические проявления менее выражены [8, 21, 86].

С момента первого выделения псевдотуберкулезного микроба L. Malassez и V. Vingal в 1883 г. от морских свинок и до начала 50-х годов XX века у людей описано 30 случаев заболевания, среди которых только 12 являются бесспорно доказанными [32]. Как самостоятельная нозологическая форма псевдотуберкулез был признан после сообщения W. Кпарр и W. Masshoff в 1953 г. о группе мезентериальных лимфаденитов (наблюдаемых у детей с клиникой острого аппендицита) псевдотуберкулезной этиологии, то есть через 70 лет после открытия возбудителя [30].

Официально о первых случаях заболевания псевдотуберкулезом сообщил W. Knapp в 1958 в Великобритании. В Канаде псевдотуберкулез регистрируется с 1962 г. [148], в США — с 1969 г. [81]. Псевдотуберкулез описан в Бразилии [117], Новой Зеландии [108], Австралии [133], Швеции [49], Дании [43], Финляндии, Норвегии [83, 103, 139], Бельгии [116], Германии [102], Австрии [149], Франции [128, 122], Испании, Италии [156], Польше [144], Болгарии [129]. В этих странах у большей части пациентов заболевания протекали с клинической картиной мезаденита, аппендицита, реже гастроэнтерита, узловой эритемы [38]. Также псевдотуберкулез регистрируется в Прибалтике [125], Казахстане [25], Японии, Китае, Корее [86] и Иордании [47]. Можно утверждать, что псевдотуберкулез распространен повсеместно.

В России клинические проявления псевдотуберкулеза настолько кардинально отличаются от симптомов заболевания в европейских странах, что Знаменскому В. Н. и Вишнякову А. К. только в 1966;1967 гг. опытом самозаражения удалось доказать псевдотуберкулезную этиологию одного из наиболее часто встречающегося на российской территории симптомокомплекса псевдотуберкулеза, так называемой, дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки (ДСЛ) [15, 16, 23]. Название этого заболевания указывает на его клиническое сходство со скарлатиной.

Многообразие клинических симптомов является причиной отсуствия единой классификации псевдотуберкулеза в России. Васильев C.B. с соавт. (1993) [5] приводит одну классификацию — Залмовера И. Ю. (1969), в ней различают следующие формы заболевания: генерализованную, абдоминальную, желтушную, артралгическую, скарлатиноподобную и катаральную. В монографии Бутяновой Н. Г. с соавт. (1991) приводится 12 классификаций, каждая из которых по своему актуальна, но в клинике обычно используется классификация Матковского B.C. (1977). [4, 24]. По основным клиническим проявлениям в ней различают генерализованную, абдоминальную, желтушную, артралгическую, скарлатиноподобную, смешанную, катаральную и стертую формыпо степени тяжести — тяжелое, средней тяжести и легкое течение псевдотуберкулезной инфекции, которая может протекать с рецидивами или без.

Существуют классификации, общие для псевдотуберкулеза и иерси-ниоза. Так, Покровский В. И. и соавт. (1986) приводят такую классификацию клинических форм иерсиниозов: гастроинтестинальная (проявляется в виде гастроэнтерита, энтероколита или гастроэнтероколита), абдоминальная (проявляется в виде мезентериального лимфаденита, терминального илеита или острого аппендицита), генерализованная (смешанная, септическая, септико-пиемическая), вторично-очаговая (артрит, узловатая эритема, миокардит, гепатит, менингит, синдром Рейтара). Проявления псевдотуберкулеза и иерси-ниоза в остром периоде и исходы болезней имеют значительное сходство.

В течении заболевания псевдотуберкулезом выделяют несколько периодов: инкубационный (4−21 день), начальный (от нескольких часов до 5 дней), разгар болезни (3−10 дней и более), ремиссия (у 2/3 больных совпадает с периодом реконвалесценции), рецидивов и обострений, реконвалесцен-ции [26].

Начало заболевания чаще всего острое, с повышения температуры до 37,5 — 39,7 0 С. Наиболее часто встречаются симптомы интоксикации: общей слабости — 97,3%, лихорадки — 96,1%, головной боли — 92,5%- боли в суставах — 59,4%- гиперемии слизистой оболочки зева — 49,8%- боли в животе -33,4 — 71,4%, увеличения печени — 31,9 — 85%, артралгии — 14−97%, которые не являются патогмоничными [21, 28]. Может наблюдаться развитие конъюнктивита, аппендицита, терминального илеита, мезаденита, артрита, гепа-типа и т. д. Характерным для псевдотуберкулеза в России является отечно-гиперемический синдром, который проявляется в виде одутловатости и красноты кожи лица и шеи — симптом «капюшона" — кистей и стоп — симптом «перчаток» и «носков», бледного носогубного треугольника, зудом ладоней и подошв, сопровождающимся появлением экзантемы с последующим отрубе-видным шелушением. По литературным данным сыпь и симптом «перчаток» и «носков» наблюдались в 42, 3 — 85% случаев [26].

В европейских странах для проявлений псевдотуберкулеза наиболее характерно возникновение лихорадки и болей в животе, иногда тошноты и рвоты. Боли внизу живота справа могут привести к хирургической операции по удалению аппендикса. При вскрытии чаще всего оказывается, что червеобразный отросток не изменен, хотя наблюдается ярко выраженный мезенте-риальный аденит и/или острый терминальный илеит. У ослабленных больных, особенно с циррозом печени вследствие алкоголизма, или с гемохрома-тозами и другими заболеваниями печени, возбудитель псевдотуберкулеза имеет особенность распространяться из пищеварительного тракта в другие органы через кровь, вызывая при этом сепсис. В целом заболевания псевдотуберкулезом в европейских странах протекают легче, чем в России, Японии и Корее [61].

В большинстве случаев заболевание имеет благоприятный прогноз и заканчивается выздоровлением. Однако проблема затяжного и хронического течения болезни с вовлечением в процесс ряда органов и систем больного остается актуальной до настоящего времени [6, 11]. При этом формирование хронических заболеваний характерно после острой инфекции как псевдотуберкулезной, так и кишечноиерсиниозной этиологии, и на данном этапе практическому врачу нередко очень трудно или даже невозможно клинически проводить между ними дифференциальную диагностику. Так, среди взрослых больных Скандинавии и России высока частота артритов иерсини-озной этиологии (от 10 до 30%) [3, 88, 110]. Чаще поражаются суставы коленей и лодыжек, но могут вовлекаться другие, в частности, межфаланговые суставы рук и стоп. Нередко поражения суставов сопровождаются уретритом, конъюнктивитом (болезнь Рейтера) и встречаются у пациентов с артритом, обусловленным Yersinia, в 5 — 10% случаевдругие заболевания — увеит, ирит, конъюнктивит, гломерулонефрит, уретрит — выявляются реже [54]. Для иерсиниозов с хроническим течением наиболее характерно возникновение эритемы нодозум, хронического поражения желудочно-кишечного тракта [28, 88,31].

Инфекционный процесс представляет собой ограниченное во времени сложное взаимодействие биологических систем микроорганизма и макроорганизма, протекающее в определенных условиях внешней среды, поэтому постоянно требуется изучение генетических детерминант вирулентности бактерий Y. pseudotuberculosis и влияния их продуктов на течение инфекционного процесса, территориальное распространение болезни.

Наиболее изученным из известных генетических детерминант вирулентности Yersinia является плазмида вирулентности иерсиний pYV 46 МДа (Plasmid associated with Yersinia virulence), обнаруженная у патогенных иерсиний: Y. pseudotuberculosis, Y. enterocoliticaу Y. pestis названа рСД1 (Calcium Dependence plasmid). Полагают, что основное значение в формировании патогенных свойств принадлежит плазмиде, которая кодирует белки наружной мембраны иерсиний Yops (Yersinia outer membrane proteins), способствующие подавлению фагоцитарной активности клеток иммунной системы макроорганизма, оказывающие воздействие на адгезию и инвазию бактерий. В таблице 1. приведены основные Yops иерсиний и их функции. При непосредственном взаимодействии с клетками макроорганизма Y. pseudotuberculosis осуществляет введение эффекторных молекул внутрь клеток лимфоидной ткани, используя при этом систему секреции III типа. Гены, ответственные за функционирование этой системы локализуются, главным образом, на плазмиде вирулентности. pYV 46 МДа определяется во всех свежевыделенных штаммах Y. pseudotuberculosis, и, по ее присутствию дифференцируют патогенные иерсинии от не патогенных [55, 71, 72, 86]. При культивировании in vitro, особенно, при 37 °C Y. pseudotuberculosis может утрачивать эту плазмиду [84].

Остров" высокой патогенности HPI (High Pathogenicity Island), ответственный за биосинтез и регуляцию системы утилизации железа, расположен на хромосоме. Впервые «остров» высокой патогенности HPI обнаружен у бактерий рода Yersinia. Его размер у Y. pseudotuberculosis составляет 36 kb. HPI состоит из 2-х частей: правой консервативной части R-HPI.

Таблица 1. Белки наружной мембраны иерсиний и их функции.

Факторы вирулентности Функция Гены Оптимальная температура экспрессии, °С Молекулярная масса, кДа.

Уаё, А Ведущий адгезин иерсиний уас1 А 37 45.

Белки-эффекторы — направляются внутрь клетки-мишени (Уор5).

УорЕ Цитотоксин, блокирунт деление клеток макроорганизма уор Е 37 23.

УорН Тирозинфосфатаза, инги-бирует фагоцитоз уор Н 37 51.

Урк А/Уор О Протеинкиназа, проявляет цитотоксическую активность, приводит к морфологическим изменениям клеток уркА /уор О 37 81,7.

Уор 1/Уор Р Апоптоз клеток лимфо-идной ткани уор Д/уор Р 37 31−32,5.

УорТ Цитотоксин, приводит к изменению цитоскелета уорТ 37 35,5.

УорМ Ингибирует активность тромбоцитов уор М 37 41,6 (56,9).

Белки, необходимы для переноса эффекторов.

Уор В Контактный гемолизинсупрессирует фактор некроза опухоли Оперон 1сЮУ эус В уор ВБ 37 41,745/41,942.

Уор Б Участвует в переносе белков-эффекторов 37 33,357/33,234.

ЬсгУ (V антиген) Контакт с рецептором клетки-мишени, иммуно-супрессия Оперон 1сЮУ8ус-БуорВВ 37 37.

Белки аппарата секреции III типа (более 20) УБС 37.

Белки, контролирующие перенос эффекторов.

Уор Ы/ЬсгЕ уор N 37 32,6.

Туе, А 1 у.е., А 37 10,8.

ЬсЮ 1сЮ 37 11.

Уор К/Уор уор регулон 37.

Yersiniabactin locus") и «нестабильной» левой части размером 9 kb. Yersiniabactin локус состоит из 11 генов, организованных в четыре оперона. По выполняемым функциям они разделены на 3 группы, отвечающие за биосинтез иерсиниабактина, образование рецептора в наружной мембране для иерсиниабактин-опосредованной транспортировки железа внутрь клетки и регуляцию этой системы. Одним из регуляторов экспрессии yersiniabactin локуса является ген irp2, он находится в правой части HPI, необходим для проявления высоковирулентного фенотипа. Ген fyuA участвует в образовании рецептора. Большинство генов, локализованных на HPI участвуют в сидерофор опосредованном захвате железа [60]. Считают, что HPI может быть спонтанно утерян из хромосомы [111].

Показано, что полный «остров» патогенности присутствует у штаммов Y. pseudotuberculosis серотипа 0:1, в то время как R-HPI характерен для штаммов серотипа ОЗ [56, 130]. Обнаружены, главным образом, европейские штаммы Y. pseudotuberculosis серотипов 0:1а иlb, несущие полный HPI [87]. Такие клинические штаммы обуславливают псевдотуберкулез с гастроинте-стинальными симптомами, с диссеминацией возбудителя из пищеварительного тракта в кровяное русло, и вызывают нередко тяжелое течение болезни. При введении мышам такие штаммы вызывают летальность в низких дозах. Клинические штаммы из того же региона серотипов 0:2, -4, -5 и -6, но без HPI выделены от больных с легкой кишечной инфекцией и не летальны для мышей в низких дозах [46, 60, 87]. Штаммы всех 3-х биотипов Y. pestis содержат HPI, в то время как у штаммов Y. enterocolitica он определен только среди штаммов высокопатогенного биотипа 1 В [74]. В настоящее время HPI обнаруживают среди многих видов энтеробактерий: у штаммов Escherichia coli, разных видов Klebsiella, Salmonella enterica и других [48, 104, 105].

Другим фактором патогенности хромосомной природы являются гены суперантигена, ответственные за синтез суператигена YPMs, названногосуперантигенный токсин Y. pseudotuberculosis (Yersinia Pseudotuberculosis Mitogen) [41, 119, 120]. До открытия YPMs у Y. pseudotuberculosis полагали, что бактериальные суперантигены (стафилококковый энтеротоксин, стрептококковый пиогенный экзотоксин и другие) экспрессировались только грам-положительными бактериями или Mycolasma artritidis. Было показано, что уровень гомологии между YPMs и токсинами этих бактерий достаточно низкий и исследователи пришли к выводу, что был открыт новый тип суперантигенов у первой грамнегативной бактерии [61]. Тем, что суперантигенный токсин синтезируют как Y. pseudotuberculosis так и Streptococcuc pyogenes (возбудитель скарлатины) — объясняется некоторая схожесть клинических проявлений этих заболеваний и необходимость проведения между ними дифференциальной диагностики.

Впервые штаммы возбудителя псевдотуберкулеза, продуцирующие этот токсин были выделены от пациентов с симптомами синдрома Кавазаки и от больных из вспышки псевдотуберкулеза в Японии [41, 152]. Суперантигенный токсин Y. pseudotuberculosis имеет 3 варианта a, b и с, которые кодируют соответствующие гены [131]. Ген уршВ на 88,9% гомологичен ypmA, а YPMa (молекулярный вес 14,5 кДа) имеет 83% гомологии с YPMb. Ген уртС отличается от ypmA на один нуклеотид [61].

Хорошо изучено воздействие YPMa на макроорганизм: стимулирует поли-клональную активацию Т-лимфоцитов (СД4+, СД8+). При этом во взаимодействие вовлекаются от 10 до 40% всех лимфоцитов. Это ведет к неуправляемой гиперпродукции цитокинов, таких как IL-2, TNF-a, IFN-y, что может вызвать синдром токсического шока [22, 101]. Было показано, что введение мышам, предварительно сенсибилизированным D-галактозамином, YPMa вызывает летальный шок. Развитие шока блокируется введением монокло-нальных антител к CD4+, TNFa и IFNy. [121, 63]. И, хотя токсический шок обычно не наблюдается у пациентов с псевдотуберкулезом, но эти экспериментальные данные показывают токсичность YPMa in vivo и потенциальные вирулентные свойства суперантигенного токсина Y. pseudotuberculosis. Другие варианты суперантигена также обладают супеантигенной активностью [61].

При исследовании 225 штаммов Y. enterocolitica и нескольких штаммов возбудителя чумы — YPMs не обнаружен [61].

Показано, что почти все клинические штаммы Y. pseudotuberculosis -95%, выделенные в Дальневосточной Азии, содержат уршА. Клинические симптомы заболевания псевдотуберкулезом на этих территориях сходны с проявлениями ДСЛ. В то же время уртВ и уртС гены были обнаружены, главным образом, у изолятов от животных и из окружающей среды [41, 64, 87]. В настоящее время высказывают предположение о том, что штаммы, обладающие геном уртВ, непатогенны и относятся к недавно открытому виду — Y. similis. [49, 140]. В проведенных ранее исследованиях выдвинута гипотеза об ассоциации генов YAPI и суперантигена [69].

Адгезивный «остров» патогенности иерсиний — YAPI (Yersinia Adhesion Pathogenicity Island), размером 98 kb, локализован на хромосоме Y. pseudotuberculosis. Он состоит из консервативной левой части, в которую входит pil локус, и правой части с метаболическими генами, в том числе содержит ген api74. Правая часть отсуствовала у некоторых штаммов этого вида, тогда как левую часть определяли у всех YAPI — позитивных штаммов, pil локус, размером 11 kb, кодирует пили IV типа — филаментозные структуры, отходящие от поверхности бактериальной клетки, короче и многочисленнее жгутиков[68]. Пили IV типа обнаружены у некоторых грамнегативных бактерий (энтеропатогенная Escherichia coli, Salmonella enterica и Vibrio cholerae) [40, 46, 50, 112, 155]. Эти структуры участвуют в клеточной адгезии на пейе-ровых бляшках [115], бактериофагальной адсорбции, плазмидном переносе [100, 106], формируют флагелин — независимую подвижность бактерии [118, 143]. При попадании в пищеварительный тракт пили помогают бактерии колонизировать клетки кишечника. Показано, что инактивация генов pil локуса приводит к уменьшению вирулентности Y. pseudotuberculosis для мышей при введении бактерий орально [67].

YAPI не обнаружен в геноме генетически близкородственного вида — у штаммов Y. pestis, тогда как его гомолог у Y. enterocolitica находится на хромосоме [67].

Не все штаммы Y. pseudotuberculosis несут YAPI, а его присуствие не зависит от серотипа штамма [67]. Клинические проявления у больных псевдотуберкулезом, от которых выделены штаммы Y. pseudotuberculosis с YAPI мало изучены.

До настоящего времени роль плазмиды pVM82 — плазмиды с мол. массой 82 МДа остается недостаточно выясненной. Последовательность нуклео-тидов не расшифрована. Показано на экспериментальных моделях, что штаммы Y. pseudotuberculosis, несущие плазмиду pVM82 оказывают антифагоцитарное и иммуносупрессивное действие, однако механизм его в настоящее время не ясен [14, 10, 35, 37]. Гинзбург A. JI. и соавт. (1988) полагает, что угнетение иммунитета связано с модификацией соответствующих антигенов в результате действия продуктов, кодируемых pVM82. Следствием этого может быть антигенная мимикрия, приводящая к появлению структурного подобия бактериальных антигенов с антигенами организма хозяина, либо эта модификация может нарушать процесс приведения антигенов к имму-ногенной форме, доступной для Т и В лимфоцитов.

Продукты, кодируемые pVM82 могут оказывать влияние непосредственно на взаимодействие Т и В лимфоцитов. В то же время утрата плазмиды не влияет на способность микроорганизмов вызывать летальную инфекцию у мышей [7]. Показано также, что Y. pseudotuberculosis с плазмидами pYV 46 МДа и pVM82, по сравнению с Y. pseudotuberculosis, содержащей только pYV 46 МДа, вызывает угнетение продукции иммуноцитокинов. Увеличивается уровень интерлейкина-1, интерлейкина-6, усиливается выработка TNFа, который обладает тканеповреждающим действием. Таким образом, активизация фагоцитов носит негативный характер, приводя к несбалансированной продукции иммуноцитокинов. Это ведет к состоянию иммунологической недостаточности, которая проявляется преобладанием генерализованных форм псевдотуберкулеза и более тяжелым течением заболевания. Двухплаз-мидные штаммы, содержащие плазмиды pYV 46 МДа и pVM82 ингибирова-ли «окислительный взрыв», угнетали бактерицидную способность лимфоцитов [14].

Шубин Ф.Н. с соавт. (1997) уделяет особое место плазмидной характеристике штаммов при изучении вспышек и спорадической заболеваемости псевдотуберкулезом, указывая на роль плазмиды pVM82 в формировании более серьезных эпидемиологических осложнений [36], хотя при проведении более поздних исследований установлено, что наличие плазмиды pVM82 у штаммов Y. pseudotuberculosis не оказывает влияние на интенсивность эпидемического процесса [33].

Показано, что штаммы Y. pseudotuberculosis, обладающие плазмидами pVM82 и pYV 46 МДа, по сравнению со штаммами, несущими только pYV 46 МДа, вызывают более тяжелое течение псевдотуберкулеза, приводя к развитию более выраженных симптомов интоксикации, частому вовлечению в процесс органов желудочно-кишечного тракта, печени, возникновению арт-ралгий и артритов[39]. Однако вывод о роли pVM82 в проявлении клинических симптомов нельзя считать окончательным, поскольку у изученных штаммов не определяли YAPI.

Ряд исследователей считают, что плазмида pVM82 встречается у Y. pseudotuberculosis серотипа 0:1 и не определяется у других генетически близкородственных видов Yersinia. Она широко распространена среди штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных в Сибири, 60,8% штаммов [33].

Таким образом, приведенные материалы свидетельствуют о связи генетических детерминант вирулентности у штаммов Y. pseudotuberculosis с клиническими проявлениями заболевания псевдотуберкулезом.

Молекулярно-генетические методы определения детерминант вирулентности иерсиний Определение родства штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных от грызунов (источник инфекции), пищевых продуктов, объектов внешней среды (фактор передачи) и больных людей, определение циркуляции штаммов в мировой популяции Y. pseudotuberculosis, являются основной задачей эпидемиологического надзора, основу которого составляет микробиологический мониторинг за иерсиниозами. Определение факторов вирулентности у возбудителей псевдотуберкулеза позволяет установить клиническое разнообразие инфекции на территории ее распространения, а также помогает понять патогенез инфекции. До недавнего времени такая штаммовая дифференциация (внутривидовое типирование) в основном строилась на выявлении феноти-пических признаков — ферментативной активности, серои фаговариантно-сти, бактериоциногении. Для псевдотуберкулезного микроба такие дифференциации ограничивались преимущественно типированием 21, известного на данный момент, серотипа. В последние годы проводят также так называемое серогенотипирование, то есть с помощью мультиплексной ПЦР определяют О-серотип штамма бактерии [52]. Хотя метод серотипирования наиболее приемлем для практических целей, он не позволяет выявить различия близкородственных штаммов одного сероварианта. Гораздо большую разрешающую способность и специфичность имеют генетические методы маркирования [38].

В 2001 г. Fukushima и соавт. изучили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) распространение таких известных на тот момент генетических детерминант вирулентности, как: pYV 46 МДа, урш и HPI [87]. Известно, что принцип метода ПЦР основан на многократном (по числу циклов) удвоении определенного участка ДНК на термоциклере, при этом специфическая амплификация нуклеиновых кислот инициируется синтетическими оли-гонуклеотидными праймерами [147]. В ходе реакции определяют участок гена, кодирующего фактор вирулентности. Так как гены суперантигена имеют.

3 аллели: ypmA, ypmB и уртСа «остров» высокой патогенности может быть полный (HPI) или с утраченной левой нестабильной частью (R-HPI) — эти факты были учтены при подборе праймеров для постановки реакций при исследовании 2235 изолятов Y. pseudotuberculosis, выделенных на территории всех континентов, в том числе 110 штаммов из дальневосточных территорий России. Возбудители псевдотуберкулеза изолированы от больных людей, млекопитающих, птиц, рыб, с поверхности овощей, из почвы и воды. Штаммы Y. pseudotuberculosis были разделены на 6 генетических групп по содержанию генетических детерминант вирулентности, причем автор предпринял попытку описать клинические проявления, обусловленные штаммами каждой группы. В первую группу, содержащую патогенный тип бактерий, включены штаммы ypmA+HPI+, серотипов О: lb, -3, -5а, -5Ь и несколько нетипируемых штаммов, все они изолированы на территориях Дальнего Востока. Клинические проявления псевдотуберкулеза, вызываемого этими штаммами требовали уточнения. Во вторую группу вошли штаммы Y. pseudotuberculosis ypm" НР1+, серотипов О: la иlbотнесенные к европейскому гастроэнтеральному патогенному типу. Клинические штаммы из этой группы были выделены от больных псевдотуберкулезом с проявлениями, характерными для Европы: лихорадка, гастроэнтеральные симптомы, мезаденит. Третья группа включала штаммы уршА+НРГсеротипов О: lb, -2а, -2Ь, -2с. -3, -4а, -4b,-5a, -5Ь, -6, -10 и нетипируемые штаммы. Эта группа получила название — дальневосточный системный патогенный тип бактерий, штаммы из этой группы обуславливают псевдотуберкулез с чертами ДСЛ, распространены, главным образом на Дальнем Востоке. Четвертая группа представляет непатогенный тип Y. pseudotuberculosis, штаммы из нее содержат только YPMb+ и относятся к серотипам 0:1Ь, -5а, -5Ь, -6, -7, -9, -10, -11, -12- были выделены от животных или из окружающей среды на территориях Дальнего Востока. В настоящее время штаммы не ферментирующие мелибиозу, входившие в эту группу, относят к недавно описанному виду Y. similis, для человека не патогенной [109, 140]. Пятая группа состояла из штаммов YPMc+R-HPI+, серотипа 0:3. Названа — европейский низкопатогенный тип, так как распространена в основном на Западе. Штаммы выделяли в 98% случаев от животных, клинические проявления у больных требуют уточнения. По данным других авторов штаммы из этой группы вызывали у животных кишечные заболевания и аборты [114]. И последняя, 6 группа, состояла из штаммов НРГурш" 15-ти различных серо-типов, не содержащих ни один из исследуемых факторов вирулентности, кроме pYV 46 МДа в 50% случаев. Группа названа патогенной, однако роль штаммов в проявлениях заболевания требует уточнения. Штаммы выделяли в основном от животных и из окружающей среды.

Таким образом, большинство штаммов разделено на два основных клона: ypm" HPI+ - европейский гастроэнтеральный патогенный тип и ypmA+HPI* - дальневосточный тип (заболевания с симптомами ДСЛ). Установлено также, что у штаммов существует прямая связь с географическим положением стран, где они выделены: третья группа штаммов уршА+НРГ доминирует в России, Японии, Кореевторая урш" НР1+ - в Европе, Австралии и Северной Америке. Выдвинуто предположение о происхождении этих штаммовуртА+НРГ — Дальний Востокypm" HPI+ - европейские территории. Также существует мнение, что те несколько штаммов европейского типа, обнаруженные на территории Дальнего Востока могли быть туда завезены между 1700и 1800 гг. с зараженным мясом животных, также как патогенная Y. enterocoliti-са в 1970 г. попала в Японию с зараженной европейской свининой и говядиной [85].

В 2006 г. Чеснокова М. В. и соавт. провели типирование штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных в Сибири, по наличию генов HPI, суперантигена и плазмидному спектру методом ПЦР [33]. Выделена доминирующая группа штаммов для территорий Сибири — ypmA+HPTpYV+pVM82+, серотипа О: lb. Однако в этих исследованиях не учитывался YAPI.

Использование факторов вирулентности как эпидемиологических маркеров позволило определить разнородность циркулирующих штаммов одного серологического варианта. Полученные результаты продемонстрировали полезность использования генотипирования выделенных культур по наличию генетических детерминант вирулентности для установления их роли в разнообразной клинической симптоматике псевдотуберкулеза.

Принцип метода дот — блот гибридизации основывается на прямом нанесении растворов нуклеиновых кислот на фильтр (дот-блот), затем их гибридизации с ДНКили РНК-зондами, имеющими метку. Традиционно для получения зондов используют радиоактивно меченые с помощью 32Р, 35 8, 1251 нуклеотиды, которые после гибридизации зонда с нуклеиновой кислотой-мишенью выявляют методом радиоавтографии. Однако большинство этих изотопов имеют малый период полураспада, что влечет за собой необходимость частого приготовления зондов. Кроме того, работа с радиоизотопами требует соблюдения строгих мер безопасности, а мероприятия по захоронению радиоактивных отходов дороги. Поиски эффективных нерадиоактивных маркеров для мечения зондов привели к созданию как минимум 2-х меток: на основе биотина и дигоксигенина. Некоторые авторы, однако, считают, что неизотопные методы не обеспечивают столь высокой чувствительности, специфичности и воспроизводимости результатов, как изотопные [34].

В основе большинства методов нерадиоактивного мечения лежат ферментативные реакции с участием нуклеозидтрифосфатов, ковалентно связанных с молекулой-свидетелем (обычно биотином). После гибридизации зонды выявляют с помощью системы на основе авидина и стрептавидина или с помощью конъюгированных с флуоресцентным красителем или ферментом антител к зонду. Использование в качестве метки дигоксигенина, по-видимому, обеспечивает большую специфичность и воспроизводимость, а чувствительность метода близка к таковой для случая радиоактивно меченых зондов [34, 53].

Дот — блот гибридизация дает простой ответ по типу да — нет и особенно полезна в тех случаях, когда проводится анализ большого числа образцов. Метод позволяет выявить аномальные (измененные или экзогенные) нуклео-тидные последовательности в любом клиническом образце, из которого можно выделить нуклеиновые кислоты, к примеру изучение мутаций в гене ретинобластомы. Также метод позволяет выявлять участки геномной ДНК бактерий и вирусов с помощью ДНК-блотов или соответствующие РНК-транскрипты с помощью РНК-блотов [34, 157]. В результате чего была предложена схема определения патогенных У. еп1егосо1Шса с помощью РНК-зондов методом дот-блот гибридизации [82].

Для определения первичной нуклеотидной последовательности генов или генома в целом проводят секвенирование ДНК. В настоящее время для стандартного секвенирования генов обычно применяют классический метод, разработанный Сэнгером и соавт. с дезоксинуклеозидтрифосфатами (сШЫТР). Обычно до начала секвенирования производят амплификацию участка ДНК, последовательность которого требуется определить, при помощи ПЦР. В основе метода, называемого также методом секвенирования путем терминации цепи, лежит принцип ферментативного построения комплементарной цепи ДНК по существующей одноцепочечной матрице при происходящем в разных местах цепи ДНК ингибировании ее дальнейшего роста. Флуоресцентную метку включают либо в праймер, либо в терминатор транскрипции согласно следующим схемам: меченный праймер (четыре разных красителя) и немеченые терминаторымеченный праймер (один краситель) и немеченые терминаторымеченые терминаторы (каждый тип терминатора своим красителем) и немеченый праймер. Использование меченных праймеров предполагает проведение четырех независимых реакций (отдельно с каждым из терминаторов) для каждого секвенируемого образца. Использование меченых терминаторов позволяет совместить все четыре реакции в одной пробирке. Если используется единственный краситель, то разделение продуктов сик-венсовой реакции в геле проводят на четырех разных дорожках. Использование четырех разных красок позволяет разгонять продукты реакции (й) на одной дорожке. В результате секвенирования получают формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде [9].

Известные методы секвенирования позволяют обрабатывать только сравнительно небольшие фрагменты ДНК. Новая, более простая и дешевая методика секвенированиядлинной геномной ДНК посредством разрезания ее на мелкие фрагменты с последующим их обычным секвенированием и финальным сопоставлением всех анализируемых участков молекулы ДНК в единую геномную карту организма называется методикой «дробовика» (Shotgun sequencing) [44].

Для определения некоторых генов вирулентности исследователи пользуются методом секвенирования участков ДНК, несмотря на его относительную дороговизну. Так, для дифференциации генов уршА и ypmC Fukushima и соавт. (2001 г.) применил метод секвенирования, так как нуклеотидные последовательности этих генов, как было установлено ранее [64], отличаются на один нуклеотид, и, следовательно, такие методы как ПЦР или ДНК гибридизация обладают недостаточной чувствительностью для их дифференциации.

В настоящее время расшифрована последовательность полного генома трех штаммов Y. pseudotuberculosis: штамма Y. pseudotuberculosis IP32953 серотипа Olb, выделенного от больного псевдотуберкулезом человека, с симптомами заболевания, характерными для Европыштамма Y. pseudotuberculosis РВ1Л серотипа 0:1b и штамма Y. pseudotuberculosis YPIII серотипа 0:3 [65, 46]. Нуклеотидные последовательности этих штаммов можно найти в GenBank и использовать для сравнения с геномами других штаммов.

Краткая характеристика молекулярно-генетических методов, применяемых для внутривидового типирования штаммов Y. pseudotuberculosis по наличию генетических детерминант вирулентности, дает представление о новых информативных возможностях «молекулярной эпидемиологии» — определение ареала возбудителя, его клоновой структуры, генетического родства между штаммами из различных источников.

Классы специфических антител, их обнаружение у экспериментальных животных и у больных иерсиниозом Гуморальный ответ на иерсиниозную инфекцию. В исследованиях, проведенных с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), у больных или переболевших иерсиниозной инфекцией теплокровных и человека обнаруживаются антитела А, М, и в. Было установлено, что определяют в течении 1-го — 3-х месяцев от начала заболевания, что свидетельствует о наличии острой инфекции-^О регистрируют до 5−14 месяцев от начала заболевания. Отмечены особенности динамики 1§-А: так, у пациентов с артритом, вызванным иерсиниями, их обнаруживали в период до 9-ти — 14-ти месяцев от начала заболевания, а при отсуствии артрита — только первые 3 месяца [70, 73, 89, 142]. У больных с иерсиниозным увеитом присуствие в сыворотке расценивали как наличие острой или персистентной (латентной) инфекции [73, 96]. Для доказательства персистенции возбудителя в организме человека были проведены специальные исследования. Так, при обследовании 10 больных с хроническим течением иерсиниозной инфекции (ХИ), подтвержденной выделением культуры и/или наличием высоких титров антител (в остром периоде), у 9-ти больных с помощью иммуноблота определяли^А и взаимодействующие по крайней мере с 2 ассоциировавши с вирулентностью белками с мол. массой 36 и 46 кДа, а у одного Полученные данные позволили авторам сделать вывод, что длительная продукция^А свидетельствует о постоянной стимуляции лимфоидной ткани персистирующими вирулентными иерсиниями, особенно, если учесть, что период полураспада^А равен нескольким дням. Это предположение было подтверждено при проведении непрямой реакции иммунофлуоресценции с О-специфической антисывороткой и при биопсии [97]. В таблице 2. представлены данные, обобщающие результаты проведенных ранее исследований.

Таким образом, можно полагать, что при наличии инфекции в острой фазе заболевания в сыворотке крови определяются 1§-М, и/или 1^Апри хроническом течение иерсиниозов — и/или ^А.

Позднее НеБеешап и соавт. (1998 г.) на кроличьей модели с помощью иммуноблота установил, что на белки У. егйегосоНйса, кодируемые плазми-дой, на 6-ой день после иммунизации индуцируются и 1§-А, которые он определял до 5-ти — 7-ми и 8-ми — 10-ти месяцев соответственнообнаруживал на 9-й день и определял в течении года от начала инфицирования [94].

Таблица 2. Сроки обнаружения иммуноглобулинов при иерсиниозной инфекции.

Иммуноглобулины.

1§-М 1§-А 1ВС.

Появление от начала заболевания (дни) 6 6 9.

Длительность обнаружения (месяцы) 5−7 3 без артрита 9−14 с артритом 5−15.

С помощью иммуноблота установлено также, что при заражении двух групп кроликов вирулентным (1-я группа) и авирулентным (2-я группа) штаммами У. еп1егосо1Шса 0:3, в обоих случаях обнаруживали [94]. При этом мажорные полосы и более продолжительный иммунный ответ на цельно-клеточный лизат регистрировали у кроликов, иммунизированных вирулентным штаммом. Антитела к белкам, кодируемым рУУ 46 МДа, в сыворотках кроликов 2-й группы не регистрировали. После реинфицирования этих же кроликов вирулентным штаммом У. еп1егосо1Шса 0:3 спустя 14 месяцев наблюдали иммунный ответ в обеих группах. Нарастание уровня на белки, кодируемые рУУ 46 МДа отмечали у кроликов из 1 -й группы, а у кроликов из 2-й группы выявляли 1§-М, 1§-А, а затем и что свидетельствует о важной роли УорБ в инфекционном процессе. Ряд работ, выполненных в последующем, подтверждают роль белков наружной мембраны иерсиний как антигенов, являющихся триггером для иммунной системы, играющих важную роль в патогенезе инфекции. Так, 81аЫЬе^ и соавт., проводя иммуноб-лот с сыворотками крови больных, переболевших иерсиниозом, регистрировал антительный ответ против ряда УорБ [141]. При этом иммунодоминант-ными являлись белки с мол. массой 26- 34- 45, 52,5 кДа. связывался с белками с мол. массой 26 и 45 кДа- 26- 34 и 52,5 кДас белками с мол. массой 26- 34- 45 и 52,5 кДа, причем последние взаимодействовали активнее, чем другие иммуноглобулины. И. В. Малов (1994 г.) также указывал на диагностическое значение белка с мол. массой 26 кДа при псевдотуберкулезной инфекции [20].

Испанские исследователи изучали иммунный ответ на заражение кроликов У. ег^егосоШюа 0:9 рУУ+, вводя им антиген внутривенно или через рот [80]. С помощью иммуноблота были определены к мажорным белкам с мол. массой 51кДа (Уор Н) и 41кДа (ЬсгУ) в двух группах кроликов, однако только у животных, зараженных через рот, определялись к кодируемым плазмидой белкам с мол. массой 35кДа (Уор Ы) и 20кДа (Уор С>). С помощью ИФА к УорН определяли количественно, при этом наибольший уровень регистрировали на 2−3 неделе от начала заболевания, а затем наблюдали его прогрессивное снижение.

Помимо Уор б, исследовали формирование антител на другие антигены белковой природы. Японские исследователи показали важную роль суперантигена (УРМ) У. рзеиёоШЬегсиП818 в патогенезе иерсиниозной инфекции [42]. При острой инфекции у 20 (61%) из 33 больных были обнаружены^О к УРМ. При этом отмечено, что у больных с системными поражениями, такими как лимфоаденопатия, ренальная дизфункция, артрит уровни обнаружены в более высоких значениях, чем у пациентов с гастроэнтестинальными проявлениями. Авторы указывают на возможное влияние суперантигена на тяжесть течения заболевания.

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что при иерсиниозной инфекции в организме человека и животных вырабатываются антитела к широкому спектру антигенов, среди которых иммунодоминант-ными являются белки с мол. массой 25−26, 36−37, 45−47 и 58 кДа [20, 75, 93, 123, 142]. Доказано, что бактерии рода Yersinia (Y. pseudotuberculosis и Y. еп-terocolitica) обладают сходными антигенными детерминантами, а антитела к Yops этих видов иерсиний перекрестно взаимодействуют в иммуноблоте с белковыми антигенами [93].

Гуморальный ответ при затяжном и хроническом течении иерсиниозов. Под затяжным течением иерсиниозов (ЗИ) понимают продолжение заболевания от 3 до 6-ти месяцев, под хроническим течением — больше 6-ти месяцев [19]. Затяжное течение иерсиниозов формируется после острого периода у 518% больных и чаще всего проявляется в виде реактивного артрита, миоак-рдита, длительного лихорадочного состояния, затяжного гастроэнтероколита, синдрома Рейтара, увеита и т. д. [138]. При остром, затяжном и хроническом течении псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза у больных людей и животных в сыворотке крови выявляется спектр антител к различным антигенам возбудителей, таблица 3.

Видно, что антитела трех классов взаимодействовали с различными антигенами Y. pseudotuberculosis и Y.enterocolitica. При этом значительно лучше изучен иммунный ответ на заражение Y. enterocolitica. Полагают, что антигены с мол. массой 19, 26, 34, 36, 46, 52,5 кДа оказывают воздействие на формирование реактивного артрита [45, 97, 141].

В одной из работ показано, что у больных с реактивным артритом, ассоциированным с иерсиниями не определили каких либо дополнительных белков, вовлеченных в иммунный ответ, в то время как связывающиеся с IgA антигены с мол. массой 26- 34 и 52,2 кДа имели тенденцию обнаруживаться при длительной персистенции возбудителя у таких больных [141].

Appel Н. и соавт. (1999) при изучении гуморального иммунного ответа на биохимически очищенный белок 19 кДа (уреазная субъединица.

Таблица 3. Спектр антител к иерсиниям в сыворотках людей и животных.

Источник Антитела Белки У. р8еиёоШЬегси1о818 (мол. масса, кДа) Белки У. е^егосоШюа (мол. масса, кДа).

Острое и затяжное течение инфекции.

Люди 1§-М 25 [13], 26 [141], 36, 38[13], 45 [141], 46, 58[13].

18А 25, 36[13] 25 [13], 26, 34 [141], 36, 38 [13], 52,5 [141]. артрит: 19 [42].

22, 26, 33, 37, 45, 59, 67 [20] 14 [141], 25 [13], 26, 28, 33, 34, 35 [141], 36, 38 [13], 45 [141], 46 [13], 50, 52,5 [141], 58 [13], 63 [141].

Животные 1ёМ, 20 УорС>, 35 УорИ [80], 35,5 [75], 41ЬсгУ, 51 УорН [80], НБРбО [154], 60 [154] артрит: 33−36, 63, 76, 88 [42]- Уас1А [113], 54, 66 [45].

Хроническое течение инфекции.

Люди 1§-А 23УорЕ, 33 УорЫ, 35УорБ, 35УорБ, 41УорВ, 44 УорМ, 51 УорН [66] артрит: 19 [42], 26, 34 [141], 36, 46 [97], 52,5 [141].

ДО 14 [141], 23УорЕ (34), 25 [13], 26, 28 [141], 33 [141, 142], 34 [141], 36 [13, 141], 37 ЬсгУ [51], 38 [13], 41УорВ, 44 УорМ [66], 45 [141], 46 [13, 66], 50, 52,5 [141], 58 [13], 63 [141].

У. егИ: егосо1Шса) у больных реактивным артритом, возникшим после заболевания, вызванного У. еп1-госо1Шса 0:3, показал, что 93% и 56%^А связывались с этим белком. Авторы считают, что этот белок участвует в возникновении реактивного артрита и рекомендуют его определение при скрининге данной патологии [45].

При моделировали реактивного артрита в опытах на хомяках, инфицированных У. егЛегосоНйса 0:8, с помощью реакции иммунофлуоресценции бактериальные антигены обнаруживали в суставе с последующей регистрацией антител в сыворотке крови, взятой на 26 день от начала заболевания, при отсутствии высева У. еггёегосоНйса из синовиальной жидкости [77]. Автором также были обнаружены антитела к антигенам с мол. массой 66 и 54 кДа. В другой работе при моделировании реактивного артрита на животных обнаружили иммуноглобулины к белкам с мол. массой 88, 76, и 33−36 кДа [76].

При изучении вероятной связи иерсиниозной инфекции с развитием переднего увеита было показано, что антитела к антигенам с мол. массой 36 и 27 кДа У. еп1егосо1Шса определяются чаще у пациентов с увеитом, чем в контрольной группе [58].

Другие авторы показали, что антитела к белку теплового шока У. еп1егосо1Шса НЭРбО, обнаруженные у пациентов с увеитом, перекрестно реагировали с ретинальным экстрактом человека и быка [145].

Имеются сообщения об участии У. егИ: егосо1Шса в формировании аутоиммунных заболеваний щитовидной железы. Так, с помощью иммунофлуо-ресцентного анализа было показано, что антитела, индуцированные антигенами иерсиний, вступали в перекрестные реакции с тиреоидными эпителиальными клетками, в то время как Уорэ содержат в себе участок для связывания тиротропина [95]. Были обнаружены также 2 Уорэ с низкой мол. массой (5,5 и 8 кДа), перекрестно реагирующие с рецептором тиротропина [66, 113]. Эти белки представлены в липополисахариде У .е^егосо1Шса и не были обнаружены в других бактериях семейства Еп1егоЬас1епасеае.

Японские ученые определяли у пациентов с первичным билиарным циррозом антитела на белок теплового шока (HSP60), полученный от У. enterocolitica, в ИФА [154].

Однако выявленные связи отдельных белковых компонентов иерсиний с развитием системных аутоимунных заболеваний или осложнений фрагментарны, требуют дальнейшего изучения.

Наиболее перспективными для использования в серологической диагностике иерсиниозов признаны антигены с молекулярной массой 51 кДа (УорН), 44 кДа (УорМ), 35 кДа (YopD), 23 кДа (УорЕ) [80, 141, 142].

Перекрестно реагирующие белки иерсиний. Мажорные белки с мол. массой 25 и 36 кДа обнаружены не только у У. pseudotuberculosis, но и у У. enterocoliticaони были предложены для скрининга заболеваний, вызванных иерсиниями этих двух видов [142]. По другим данным у У. pseudotuberculosis и У. pestis обнаруживаются мажорные белки с мол. массой 36- 62 (находили только при заражении живой культурой) и 73 кДа. Известно, что антигенная фракция 62 кДа соответствует белку теплового шока У. enterocolitica [13]. Антиген, имеющий мол. массу 73 кДа соответствует белку теплового шока кишечной палочки DnaK. У обоих видов иерсиний обнаруживали антитела на минорные антигены с мол. массой 13, 30, 34, 37, 5654 кДа.

Антигены с мол. массой 5,5 и 8 кДа кодируются хромосомой и представлены как у вирулентных так и у авирулентных иерсиний (У. pestis, У. pseudotuberculosis, У. enterocolitica). Эти белки вступают в перекрестные реакции с рецептором тиротропина [113].

Обнаружены антитела к белкам с мол. массой 11,5 и 21 кДа у У. enterocolitica, Brucella abortus и Afipia clevelandensis. Можно полагать, что эти антигены ответственны за перекрестные реакции между этими видами бактерий [78].

Таким образом, показано, что при хроническом течении иерсиниозной инфекции оптимально исследовать как минимум два иммуноглобулина IgG и.

IgA. В организме больного или переболевшего иерсиниозами человека или животных образуются антитела к широкому спектру белков иерсиний, среди которых значительную роль в иммуногенезе играют Yops Yersinia.

Серологическяа диагностика иерсиниозной инфекции на разных стадиях заболевания Многообразие клинических проявлений иерсиниозов, наличие значительного числа случаев с атипичным, стертым или хроническим течением нередко затрудняют клиническую диагностику этих инфекций. Вместе с тем надежная и достоверная серодиагностика во многих случаях играет решающую роль в выборе клинической тактики лечения больного и проведении профилактических мероприятий.

Широкое распространение иерсиниозов, их современные экологоэпи-демиологические особенности, а также значительная роль в инфекционной патологии человека делают вопросы лабораторной диагностики этих заболеваний актуальными.

С целью подтверждения диагноза в остром периоде заболевания исследуют испражнения больного или биопсийный материал при хирургических вмешательствах. Однако эффективность бактериологического метода не высока и составляет — 7−10%. В нашей стране для экспресс диагностики в остром периоде заболевания используют метод полимеразной цепной реакции (ПНР), однако в поздние сроки болезни его эффективность снижается [38]. После острого периода заболевания иерсинии, как правило, в выделениях больного не обнаруживают.

Серологические методы исследования направлены на выявление специфических антител в сыворотках крови у больных и переболевших и информативны, начиная со 2−3-й недели от начала болезни. В практической медицине для подтверждения диагноза широкое применение получили такие серологические методы, как реакция агглютинации (РА) и реакция непрямой гемагглютинации (РИГА).

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Наиболее распространенный метод серологической диагностики псевдотуберкулеза, используемый в практических лабораториях. Принцип реакции основывается на способности эритроцитов концентрировать антиген на своей поверхности и склеиваться, образуя видимый осадок, при вступлении в контакт со специфическими антителами. Набор для постановки РНГА выпускается СанктПетербургским НИИ вакцин и сывороток. Выпускаются наборы для диагностики антител только к Y. pseudotuberculosis 0:1 и Y. enterocolitica 0:3 и 0:9. Впервые при псевдотуберкулезе эту реакцию применил Королюк A.M. (1969г.) [17]. Диагностический титр РНГА — 1:200. При исследовании парных сывороток диагноз подтверждался в 77.5% - 81.7% случаев на 2−3-х неделях заболевания [18]. Бургасовой О. А. и соавт. (1996) показано, что во все периоды болезни процент обнаружения специфических антител составил от 8 до 46% при среднем значении титров антител 1:100 1:200, но не более 1:400 [2]. Следует заметить, что дигностическая эффективность РНГА в значительной степени зависит от качества диагностикума, так как эритроциты барана могут разрушаться при хранении.

Реакция агглютинации (РА).В основе этой реакции лежит способность корпускулярных антигенов склеиваться и выпадать в осадок под влиянием антител в среде с содержанием электролитов. РА позволяет обнаружить наличие специфических антител в сыворотке крови больных псевдотуберкулезом к 8−10-му дню болезни в 60−80% случаев [99]. Макси мальный их уровень наблюдается к Зй неделе с последующим снижением через 6−12 мес. Диагностическим титром, как и при РНГА, принят 1:200. Бургасова О. А. и соавт. (1996 г.) выявляли специфические антитела при псевдотуберкулезе в РА во все периоды болезни [2].

Следует отметить, что препараты для РНГА и РА получены на основе антигенов преимущественно липополисахаридной природы. Вместе с тем известно, что при начальных этапах взаимодействия Y. pseudotuberculosis с макроорганизмом и, особенно, в процессе инвазии и их размножения в организме хозяина важную роль играют белки наружной мембраны, детерминированные хромосомным inv геном и генами плазмиды вирулентности иерси-ний pYV 46 МДа. Последняя обнаруживается только у вирулентных бактерий рода Yersinia. Вместе с тем в указанных реакциях не учитываются низкие титры антител из-за возможных перекрестных реакций с другими бактериями (Brucella, Escherichia, Salmonella, Borrelia), хотя не редко этиологическое значение иерсиний нельзя отрицать [132].

В последнее время широкое применение получил иммуноферментный анализ (ИФА), эффективность которого наиболее высока в острый период заболевания [8].

Иммуноферментный анализ. Принцип этой реакции основан на образовании комплекса антиген антитело, выявляемого с помощью второго антитела, меченного пероксидазой хрена (конъюгат). При последующем добавлении субстратной смеси развивается ферментативная реакция, регистрируемая по окрашенному продукту. Интенсивность реакции учитывают с помощью спектрофотометра при длине волны 492 нм, хотя возможна визуальная оценка реакции. Метод отличается высокой чувствительностью, возможностью качественного учета результатов и быстротой постановки реакции [90]. При исследовании сывороток крови больных отмечено, что титры антител, выявляемые методом ИФА, в сравнение с РА и РНГА превышают последние. Портнягиной О. Ю. и соавт. (2001) разработана тест-система на основе ИФА с использованием в качестве антигена видоспецифического белка — порина наружной мембраны Y. pseudotuberculosis, названного авторами иерсином [29]. Тест система прошла успешную апробацию на базе лечебных учреждений г. Владивостока. При исследовании 114 сывороток взрослых больных и 218 сывороток больных детей показано, что эффективность ИФА почти в 2 раза выше по сравнению с РНГА. В Санкт-Петербургском НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера разработана высокочувствительная ИФА тест система, в качестве антигена в которой используются 4 рекомбинантных белка наружной мембраны иерсиний. Тест система апробирована на вспышке псевдотуберкулеза в г. Новый Уренгой и показала высокую эффективность [8].

Наибольшие трудности представляет диагностика иерсиниозов при хроническом течении заболевания. Чаще всего оно проявляется реактивным полиартритом, миокардитом, узловатой эритемой, синдромом Рейтара, увеитом и т. д. В мировой практике для этих целей применяется метод иммуноблота, основанный на качественном определении антител к конкретным Yops иер-синий, нанесенным на стрипы из нитроцеллюлозной мембраны. Для эитих целей используют белки иерсиний, полученные из живых бактерий или ре-комбинантные белки. При хронической инфекции рекомендуют определять IgG и IgA, хотя существуют наборы и для поиска IgM. Иммуноблот используют также как референс метод в сложных диагностических случаях и для определения перекрестной реактивности антител. Результаты проведенных исследований показывают высокую чувствительность и надежность этого метода. Rawlins M.L. и соавт. (2005) показал высокую диагностическую эффективность метода по сравнению с РСК и ИФА [132].

В настоящее время доступны коммерческие наборы для качественного определения in vitro антител класса G или, А к антигенам патогенных Yersinia в сыворотке или плазме крови человека производства фирмы Euroimmun, а также фирмы Recom Veil. Однако исследование сывороток больных в имму-ноблоте не получило широкого распространения в практических лабораториях, а используется в основном в научных целях, возможно, из-за дороговизны исследования.

Таким образом, при остром течении иерсиниозов серологическую диагностику преимущественно проводят при помощи РНГА, РА и ИФА. Однако, для диагностики ХИ, наиболее перспективен метод иммуноблота, в настоящее время недостаточно распространенный в практических лабораториях.

Цели и задачи.

Цель исследования:

Молекулярно-генетическая характеристика штаммов.

Y. pseudotuberculosis и совершенствование этиологической диагностики иер-синиозов.

Задачи работы:

1. Изучить наличие генетических детерминант вирулентности у штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных в различных географических регионах мира.

2. Охарактеризовать генотипы штаммов Y. pseudotuberculosis различного происхождения и их распространенность в разных регионах мира.

3. Установить особенности клинического течения псевдотуберкулеза, вызванного штаммами Y. pseudotuberculosis различных генотипов.

4. Разработать набор для серологической диагностики иерсиниозов.

Научная новизна.

С использованием метода дот-блот гибридизации у штаммов Y. pseudotuberculosis различного происхождения выявлена плазмида pVM82, несущая гены вирулентности, основные из них — гены icm/dot системы секреции IVB типа, опосредующие внутриклеточное персистирование микроорганизма в эпителиальных клетках, что может обуславливать скарлатиноподоб-ные проявления заболевания.

Впервые изучена распространенность pVM82 у представителей мировой популяции Y. pseudotuberculosis.

На основании содержания основных генетических детерминант вирулентности: pVM82, генов суперантигена, YAPI и HPI выделено 14 генотипов штаммов Y. pseudotuberculosis. Показано распространение штаммов.

Y. pseudotuberculosis различных генотипов на территориях 25 стран пяти континентов.

Установлено, что псевдотуберкулез с симптомами ДСЛ вызывают все штаммы У. pseudotuberculosis, обладающие геном уршА, кодирующим УРМа.

Получены новые знания о тяжести течения псевдотуберкулеза, обусловленного штаммами У. pseudotuberculosis генотипов За, ЗЬ, Зс. Полученные данные могут свидетельствовать о более тяжелом течении инфекции, вызванной штаммами Y. pseudotuberculosis генотипов 3b (ypmA+L-YAPI+) и Зс (ypmA+L-YAPI+pVM82+), по сравнению с инфекцией, обусловленной штаммами У. pseudotuberculosis генотипа За (уртА+).

Теоретическая и практическая значимость работы.

Изученные российские штаммы Y. pseudotuberculosis и их характеристики представлены в коллекции лаборатории бактериальных капельных инфекций ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург.

Для повышения эффективности диагностики псевдотуберкулеза обоснованы показания к обследованию больных с симптомами острого аппендицита, мезентериального лимфаденита и гастроэнтеральными симптомами с целью выявления их инфицированности У. pseudotuberculosis генотипов 2а и 2Ь, вызывающих инфекцию с абдоминальными проявлениями.

Для микробиологического мониторинга за возбудителем псевдотуберкулеза предложена методика генотипирования штаммов Y. pseudotuberculosis.

Разработана методика конструирования набора для выявления специфических противоиерсиниозных иммуноглобулинов G, А, и М в крови или плазме человека методом иммуноблота.

На основе результатов работы подготовлены следующие документы:

1. Методические рекомендации для эпидемиологов, инфекционистов, педиатров и микробиологов «Псевдотуберкулез и иерсиниоз» Г. Я. Ценева, Г. И. Кокорина, Е. А. Воскресенская и др. СПб, 2005. — 49 с.

2. Материалы диссертации представлены в монографии «Иерсинии и иерси-ниозы» (Глава 8, «Современные возможности лабораторной диагностики псевдотуберкулеза и иерсиниоза» Г. Я. Ценева, Г. И. Кокорина, Е. А. Воскресенская и др.) СПб.: ООО «Бастион», 2006. — 168 с.

3. СП 3.1.7.2615−10 «Профилактика иерсиниоза» М., 18 с.

4. Патент на изобретение «Тест-штамм Yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы I». -№ 2 465 319 от 16.09.2011. — Авторы: Кокорина Г. И.

5. Патент на изобретение «Тест-штамм Yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы 1а». -№ 2 465 321 от 16.09.2011. — Авторы: Ценева Г. Я., Кокорина Г. И., Климов В.Т.

6. Патент на изобретение «Тест-штамм Yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы II». -№ 2 465 317 от 16.09.2011. — Авторы: Кокорина Г. И., Воскресенская Е. А., Чес-нокова М.В.

7. Патент на изобретение «Тест-штамм Yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы На». — № 2 465 318 от 16.09.2011. — Авторы: Кокорина Г. И., Воскресенская Е. А., Климов В.Т.

8. В Государственную коллекцию патогенных бактерий «Микроб» Российского НИПЧИ «Микроб» депонировано 4 охраноспособных штамма Yersinia pseudotuberculosis.

9. Материалы диссертации представлены в «Национальном руководстве по клинической лабораторной диагностике» (Раздел: «Иерсинии»), — М.: ГЭО-ТАР-Медиа, 2011. 2 т.

Методология и методы исследования.

Материал для исследования использованными методами представлен в таблице 4.

Таблица 4. Объем проведенных исследований различными методами.

Методы Объем.

1. Бактериологический:

1.1 Изучение характеристик циркулирующих штаммов Y. pseudotuberculosis 232 штамма.

1.2 Культивирование на питательных средах Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica 314 штаммов.

2. Молекулярно-генетический:

2.1. Определение нуклеотидной последовательности плазмиды pVM 82 (секвенирование) методом «дробовика» 1 плазмида.

2.2. Секвенирование участка генов урш локуса Y. pseudotuberculosis 23 штамма.

2.3. Выделение тотальной ДНК методом фенол-хлороформной экстракции 313 штаммов.

2.4. Выделение плазмидной ДНК методом щелочной экстракции по Бирнбоу-Долли с модификацией 1 штамм.

2.5. Дот-блот гибридизация ДНК каждого штамма с 10-ю 2770 реакций мечеными зондами.

2.6. ПЦР 650 реакций.

3. Иммунологический:

3.1. Определение уровня антител в сыворотках крови людей методами РА, РНГА, ИФА, иммуноблота 3.2. Определение уровня антител в сыворотках крови иммунизированных животных методами РА, РНГА, ИФА, иммуноблота 241 образцов сыворотки крови (ОСК) бОСК.

4. Экспериментальный: получение гипериммунных кроличьих иерсиниозных сывороток и сывороток на композицию рекомбинантных белков Yops 6 оке.

5. Анализ историй болезни 256 историй болезни.

6. Биоинформатические: — обработка данных с использованием компьютерных программ: BlastN — для сравнения исследуемой нуклеотидной последовательности с имеющимися в GenBank, Choice of Primers by the Octa-mer Frequency Disparity (OFD) Method — для выбора праймеров при постановке ПЦРTIGR Manatee system — сборка и аннотация генома плазмиды. 3 пары праймеров плазмида.

Штаммы. Методы культивирования Использовано 309 штаммов Y. pseudotuberculosis: 232 из коллекции национального Референс-центра по мониторингу за иерсиниозами, выделенные на территории России и Украины за период 1989 по 2008 гг. и 77 штаммов полученных из Коллекции Национального Yersinia референс-центра и Центра сотрудничества с ВОЗ Парижского института Пастера (из 25 стран мира).

Штаммы выделены от людей, млекопитающих, птиц, с овощей и фруктов и из окружающей среды.

В работе использованы 4 референс-штамма, содержащие различные детерминанты вирулентности Y. pseudotuberculosis из Национального Yersinia референс-центра и Центра сотрудничества с ВОЗ Парижского института Пастера.

Плазмиду pVM82 выделяли из штамма Y. pseudotuberculosis IP31758, изолированного от больного псевдотуберкулезом, с типичными симптомами ДСЛ в Приморском крае.

Для иммунизации кроликов использовали охраноспособный штамм Y. enterocolitica 0:3 КМ 174 (Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб», Саратов), содержащий плазмиду pYV 46 МДа из коллекции ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера.

В исследовании использованы как свежевыделенные культуры, так и музейные штаммы, хранящиеся при при -80° С. Бактерии выращивали в бульоне Luria Bertram или мясопептонном бульоне при 28° С 24 ч, затем культивировали при 28° С 24 ч на чашках с агаром Luria Bertram или агаре Хоттингера.

Выделение иерсиний из материала, полученного от больных, проводили посевом в пептонно-калиевую накопительную среду с инкубацией при температуре 5+1 °С и периодическим высевом на дифференциально-диагностическую плотную среду СБТС. Идентификацию культур проводили по общепринятой методике с учетом морфологических, культуральных и биохимических признаков. Серотипирование культур Y. pseudotuberculosis осуществляли в мультиплексной ПЦР с использованием специфичных прай-меров по методике Bogdanovich Т. [52] или с использованием набора коммерческих моновалентных сывороток (производства ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) к серотипам Y. pseudotuberculosis 0:1 и 0:3 с помощью реакции агглютинации на стекле по общепринятой методике.

Молекулярно-генетические методы Метод дот-блот гибридизации. Как известно, принцип метода заключается в нанесении на нитроцеллюлозную мембрану (НЦМ) ДНК исследуемых штаммов с последующим отжигом их с мечеными зондами. По интенсивности включения зонда в гибридных молекулах можно определить наличие определенных последовательностей нуклеотидов.

Генотипирование штаммов Y. pseudotuberculosis с помощью метода дот-блот гибридизации включает несколько основных этапов, рисунок 1.

Выделение тотальной бактериальной ДНК осуществляли методом фенол-хлороформной экстракции как описано ранее [59].

ДНК штаммов денатурировали в термоциклере при 95 °C в течении 5 минут и наносили по 5 мкл на положительно заряженную нейлоновую мембрану (Hybond К1″ - Amersham, Англия) размером 10×13 см, подсушивали при комнатной температуре. На одну мембрану наносили 4 ДНК референс.

Вьщеление ДНК.

Перенос ДНК на мембрану.

J J J.

Фиксация ДНК.

Учет результатов.

Гибридизация зондами.

Рисунок 1 — Этапы генотипирования Y. pseudotuberculosis с помощью метода дот-блот гибридизации. штаммов по 1,5 нг (таблица 5.) в двух повторностях и максимально до 88 ДНК исследуемых штаммов. На мембране ДНК фиксировали, облучая.

Таблица 5. Референс штаммы Y. pseudotuberculosis, использованные при проведении дот-блот гибридизации и ПЦР.

Номер штамма Серотип ОДетерминанты вирулентности Y. pseudotuberculosis Источник.

IP32953 1Ь уорМ1″, yscQ+, irp2+, fyuA+ P. S.G. Chain [65].

487/90 6 ypmB+ C. Carnoy [64].

IP32777 lb pilPQ+, api74+, yopM+, yscQ+ F. Collyn [67].

IP31758 lb ypmA+, pilPQ+, dotO+, mucAB+ Изучен в данном исследовании ультрафиолетовыми лучами в течение 4 минут с использованием прибора GS Gene Linker UV Chamber (Bio Rad) в режиме СЗ.

Зонды получали с помощью 10 пар праймеров, специфичных для искомых генов (табл. 6), синтезируя их методом ПЦР, используя как матрицу соответствующие референс штаммы (таблица 5). Праймеры, впервые синтезированные для этой работы подбирали с использованием компьютерной программы Choice of Primers by the Octamer Frequency Disparity (OFD) Methodс помощью BlastN сравнивали найденную нуклеотидную последовательность с имеющимися в GenBank.

Для очищения продуктов ПЦР от агарозы и примесей применяли набор микроколонок QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Мечение продукта ПЦР пероксидазой и использование его в качестве комплементарного ДНК-зонда для гибридизации с фиксированными на мембране ДНК исследуемых штаммов осуществляли при 42 °C с помощью набора реагентов для мечения ECL в соответствии с инструкцией производителя (ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection SystemsAmersham, Англия). Для выявления ДНК иерсиний, гибридизованных с зондами, мембрану обрабатывали с помощью набора реагентов ECL и экспонировали в течении 30 минут на светочувствительной пленке Hyperfilm ECL, помещенной в кассету.

Таблица 6. Последовательности праймеров, использованные для генетического типирования штаммов У. р5еиёоШЬегси1о818.

Фактор вирулентности Ген Праймер последовательность (5″ -3') Размер продукта ПЦР (п.н.) Источник.

УРМЬ уртВ Б: СТАОАТААТАААААТСАОААТСАТСО И: ОСТААТССАОАОАААААТСТТААТСТС 102 Данное исследование.

УРМа, УРМс уршА, уртС Б: САСТТТТСТСТСОАСТАОСО Я: АСАООАСАТТТССТСА 422 [61].

НР1 щ>2 Б: ААООАТТСОСТСТТАССООАС И: ТССТСОООСАОССТТТСТТСТ 280 [132].

НР1 1уиА Б: СТТТАТССТСТСОССГШОО К: СТСАСААСАСТАОАСОАО 149 Данное исследование.

УАР1 рПР () Б: ТАТСТТССТСОАООСТСАО К: ОСОААСТАТСАОСТАТАСО 569 [69].

УАР1 ар! 74 Б: ООТСОСТСТСТОТТТСТТСА Я: АААТТАСООААСССАСТАОСС 941 [68] рУУ уорМ Р: АТААСТСАТСОООООСААААТ Я: ОССТТАТТТАТССОААТТТАОС 565 [151] рУУ уБсО Б: ТАТССОСАТТАТСТСОООАС Я: ТТААССОССОАСТТАСТАОО 178 Данное исследование рУМ82 аою Р: АТСАГСОАГООТТСАСТООО Я: АТТСАТТССТТСАООТСТТСО 2811 Данное исследование рУМ82 тисАВ Р: ТТАСТТСТТССООСТАТСОО Я: ТСТССТТТАТСОСАААООО 1165 Данное исследование.

Пленку проявляли, фиксировали, используя реактивы Кодак, и высушивали при комнатной температуре.

После проявления пленки, результаты учитывали визуально по интенсивности включения зонда в гибридных молекулах (Рисунок 2).

В ходе постановки метода применен зонд уорМ, полученный с помощью ПЦР, используя ДНК референс штамма 1Р32 953 в качестве матрицы и специфические праймеры уорМ-Р и уорМЛ. В позиции, А — 1 (1Р32 777), 2 (487/90), 3 (1Р31 758), 4 (1Р32 953) и Н — 9 (1Р32 777), 10 (487/90), 11 (1Р31 758), 12 (1Р32 953) нанесены ДНК референсных штаммов. Интенсивность пятен А-1, 4 и Н- 9, 12 — использовали в качестве положительного контроля (ДНК содержит уорМ) — А-2,ЗиН-10, 11- использовали в качестве отрицательного контроля (ДНК не содержит уорМ).

Рисунок 2 — Результаты дот-блот гибридизации. Пленка НурегШт ЕСЬ после проявки.

При сомнительном результате искомую детерминанту вирулентности исследуемого штамма определяли с помощью ПЦР со специфичными прай-мерами для каждого гена (Таблица 5.).

ДНК референсных штаммов Положительный результат.

ДНК референсных штаммов.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) применяли для приготовления зондов и для детекции генетических детерминант вирулентности у штаммов Y. pseudotuberculosis. Финальный объем реакционной смеси для ПЦР составил 50 мкл и содержал 1,25 U Taq ДНК полимеразы (Roche/Cetus) с прилагаемым буфером, MgCl2 в концентрации 2 мМ и по 200 мкМ каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов. Все праймеры использовали в финальной концентрации 0,3 мкМ. ПЦР проводили по программе: 1 цикл 94 °C -3 мин- 30 циклов амплификации 94 °C — 30 сек, 55 °C — 1 мин, 72 С — 2 мин- 72 °C — 10 мин на термоцикл ере РТС-100 (MJ Pesearch, Inc). Продукты ПЦР разделяли методом электрофореза в 1% агарозном геле с окрашиванием эти-дий бромидом.

Определение нуклеотидной последовательности генома плазмиды по методике «дробовика». Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочной экстракции ДНК по Бирнбоу-Долли с модификацией как описано ранее [79].

Плазмидную ДНК подвергали случайному дроблению как описано ранее [124]. Последовательность генома плазмиды была собрана используя Се-lera assembler как описано ранее [98]. Для аннотации генома использовали TIGR Manatee system.

Определение нуклеотидной последовательности участка гена суперантигена. Для секвенирования генов уртА и уртС проводили ПЦР со штаммами Y. pseudotuberculosis с использованием праймеров уртА (таблица 2.3.). Продукт ПЦР очищали, применяя набор микроколонок QIAquick PCR purufi-cation Kit (Qiagen). Секвенирование проводили, используя Big Dye terminator cycle sequencing FS Ready Reaction kit (Perkin-Elmer) и ABI Prism 310 genetic analyzer (Perkin-Elmer).

Способы получения гипериммунных сывороток.

Штамм Y. enterocolitica 0:3 KM 174 в S-форме культивировали 24 ч в мясопептонном бульоне, затем 24 ч на агаре Хоттингера (рН 7,2) при 28 °C, готовили взвесь бактерий в физиологическом растворе с концентрацией 109 кл/мл.

Для получения гипериммунных сывороток использовали кроликов массой 2,5 — 3 кг. Животных иммунизировали штаммом Y. enterocolitica 0:3 КМ 174 по схеме: под конъюнктиву — 0,1 мл, через Здня и далее вводили такую же дозу внутривенно трехкратно с интервалом Здня, через 7 дней — под конъюнктиву, через 3 дня однократно внутривенно.

Также готовили гипериммунные сыворотки к комплексу рекомбинант-ных белков (Yops) YopM Y. enterocolitica, YopE Y. enterocolitica, YopH Y. enterocolitica, YopD Y. enterocolitica (Cat. No. #RPY003, #RPY004, #RPY005, #RPY006 «Omnio AB», Швеция). Кроликов иммунизировали по схеме: внутримышечно — 10 мкг двукратно с интервалом в 7 дней, внутрибрюшинно — 2,5 мкг через 14 дней, подкожно — 15 мкг через сутки, внутрибрюшинно двукратно по 15 мкг через 3 дня, внутривенно по 15 мкг через 4, 2, и 2 дня соответственно.

Иммунологические методы.

Иммуноблот. Для выявления антител к иерсиниям методом иммуноб-лота применяли диагностический набор Иммуноблот (А) для качественного определения in vitro антител классов G, М и, А к антигенам патогенных Yersinia в сыворотке или плазме крови человека методом Лайн-блота, разработанный в ходе настоящего исследования. Электрофорез белков проводили по Laemmli U. К. [107], с использованием камеры для вертикального электрофореза Mini-Protean Tetra CellBio-Rad, США. Для переноса белков на НЦМ по Towbin Н. [150] полусухим методом применяли аппарат Trans-Blot Semi-Dry Transfer CellBio-Rad, США.

В качестве препарата сравнения использовали коммерческий набор (Иммуноблот (К)) для качественного определения in vitro антител класса G или, А к антигенам патогенных Yersinia в сыворотке или плазме крови человека методом Вестерн-блота «Иерсинии IgG Вестерн-блот» и «Иерсинии IgA.

Вестерн-блот" производства «Euroimmun», Германия. Исследование проводили согласно инструкции, прилагаемой к набору.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Для выявления антител к иерсиниям использовали РНГА с коммерческими эритроцитарными диагно-стикумами: псевдотуберкулезным и кишечноиерсиниозными 0:3 и 0:9 (производство НИИВС, Санкт-Петербург). Постановку реакций проводили согласно прилагаемым инструкциям.

Реакция агглютинации (РА). Для постановки РА использовали иерси-ниозные корпускулярные антигены наиболее распространенных серотипов: Y. pseudotuberculosis серотипа 0:1 и 0:3, Y. enterocolitica серотипов 0:3- 0:5,27- 09 (производство ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера). Корпускулярные антигены представляют собой 10 млрд. взвесь иерсиний эталонных штаммов указанных серотипов в S-форме, инактивиро-ванных формалином, суспендированных в 0,9% растворе хлорида натрия. Перед постановкой антигены разводили 1:10, исследуемые сыворотки прогревали при 56 °C 30 мин для устранения неспецифических гемагглютини-нов. Реакцию ставили методом равных объемов (0,5 мл сыворотки + 0,5 мл антигена). Диагностический титр — 1:160. Постановку и учет реакции проводили в соответствии с инструкцией по применению.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Для выявления иерсиниозных антител методом ИФА использовали коммерческие тест-системы «Иерсиниоз-ИФЛ-IgA», «Иерсиниоз-ИФА-IgA», «Иерсиниоз-ИФА-IgM» (ООО «Ом-никс», Санкт-Петербург), предназначенные для выявления антител классов А, М и G к белкам наружной мембраны иерсиний. Постановку реакций проводили согласно прилагаемым инструкциям.

Методы математической обработки данных Результаты исследований обрабатывали методом вариационной статистики с вычислением средней арифметической М, среднего квадратического отклонения 5 и ошибки средней арифметической ш по формулам 2.1, 2.2, 2.3 соответственно:

ТУ.

М = (2.1) п.

3 = (2.2).

V п т = (2.3) л/И где — У[УгУп] - варианты признакап — число вариант.

Расчет показателя, выраженного в процентах производился по известной формуле: р = — х100% (2.4) п где N — количество объектов, имеющих данный признакп — общее количество объектов (общее число выборки). Стандартная ошибка показателя, выраженного в процентах определялась по формуле 2.5: где шр — стандартная ошибка показателяр — показатель.

— Отличия между выборками оценивались по параметрическому критерию Стьюдента (1:). I — критерий рассчитывали по формуле 2.6: М-М I 2 2 (2−6) л]м,.

С вероятностью ошибки р<0,05 разность результатов исследования считали статистически значимой при числе степеней свободы К=П1+п2−2 по таблице значений критерия 1.

Использовался также параметрический критерий Фишера (Б):

2.7) где 8 — среднеквадратичные отклонения сравниваемых выборок.

Для расчета чувствительности и специфичности анализов использовали формулы 2.8 и 2.9 соответственно.

Чувствительность = ——— х 100% (2.8).

П + ЛО У ' где П — число положительных проб, правильно распознанных тест-системой;

ЛО — число ложноотрицательных результатов, соответствующее числу положительных проб, не распознанных тест-системой. где О — число отрицательных проб, правильно распознанных тест-системой;

ЛП — число ложноположительных результатов, соответствующее числу отрицательных проб, ошибочно распознанных тест-системой как положительные.

В основном математическую обработку выполняли на ПК с использованием стандартных статистических пакетов 8ТАТ18Т1СА 6.0, а также использовали калькулятор.

Специфичность =-х 100%.

О + ЛП.

2.9).

Положения, выносимые на защиту.

1. Для штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных на территории России и Японии, в сравнении со штаммами, выделенными на территории Европы, Северной и Южной Америк, Австралии и Африки характерно наличие различных генетических детерминант вирулентности (уршА, ypmB, ypmC, HPI, R-HPI, YAPI, L-YAPI, pVM82).

2. У штаммов Y. pseudotuberculosis охарактеризовано 14 генотипов: 1а (НР1+ уршА+), 2а (НРГ), 2b (HPI+L-YAPI+), 2с (HPI+YAPI+), За (уршА+), 3b (ypmA+L-YAPI+), Зс (ypmA+L-YAPI+pVM82+), 3d (ypmA+pVM82+), 4 (ypmB+), 5а (R-HPI+ ypmC+), 5b (R-HPI+ ypmC+L-YAPI+), 6a (HPIypm" YAPI" pVM82″), 6b (L-YAPI+), 6c (pVM82+). Установлена особенность распространенности штаммов Y. pseudotuberculosis различных генотипов на территориях 25 стран мира пяти континентов.

3. У больных псевдотуберкулезом, от которых выделены штаммы генотипов ЗЬ и Зс достоверно чаще выявляются поражения печени, что утяжеляет течение болезни, по сравнению с пациентами, заболевание которых обусловлено Y. pseudotuberculosis генотипа За.

4. Применение набора, разработанного для выявления специфических противоиерсиниозных иммуноглобулинов G, А, и М в крови или плазме человека методом иммуноблота, позволяет проводить этиологическую диагностику иерсиниозов, в том числе с хроническим течением. Чувствительность диагностического набора составляет 90,9±2,7%, специфичность 95,2±3,3%.

Степень достоверности и апробация результатов.

Штаммы Y. pseudotuberculosis, использованные в работе выделены от больных, животных, с продуктов питания в ходе расследования вспышек псевдотуберкулеза, а также спорадических случаев заболевания и при текущем эпидемиологическом контроле. Больные включены в исследование на основании лабораторного подтверждения диагноза иерсиниозной инфекции при отрицательных результатах обследования на другие инфекции вирусной и/или бактериальной этиологии, за исключением сопутствующих инвазий, а также при отсутствии соматической патологии.

Статистическая обработка данных проведена методами статистического анализа при помощи стандартных пакетов программ 8ТАТ18Т1СА 6.0. Для оценки достоверности различий между несколькими группами наблюдений использованы методы дисперсионного анализа. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента (1) и величины вероятности (р). За достоверность различий принимали значение р<0,05, вероятность различий составляла 95% и более.

По теме диссертации опубликованы: 18 научных работ, в том числе 4 -в изданиях, рекомендуемых ВАК, а также в материалах симпозиумов, научно-практических конференций всероссийского и международного уровней.

Основные результаты исследований доложены и обсуждены на российских и международных конференциях в 2006 -2011 гг.: 22−24 марта 2006 г. СПб, Российская научно-практическая конференция, посвященная 110 -летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии им. С. М. Кирова «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины" — 12−13 октября 2006 г. СПб, II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями" — 11 апреля 2006 г. НИИЭМ им. Пастера, СПб, заседание общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области- 2−4 июня 2008 г. СПб, Четвертая международная конференция «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями" — 18−20 мая 2010 г. СПб, НИИЭМ им. Пастера, Международная конференция «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями" — 10−12 ноября 2010 г. СПб, НИИЭМ им. Пастера Семинар «Унификация лабораторных методов индикации и идентификации иерсиний и антител к ним"-24−25 ноября 2011 г. СПб, 8-я Северо-Западная научная гастроэнтерологическая сессия «Гастроэнтнрология. Гепатология. Колопроктология. Фармакотерапия. Питание." — 12−15 октября 2011 г. СПб, Третья всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями».

Личный вклад автора.

Основные результаты получены лично автором. Выделение штаммов проведено в Центрах эпидемиологии и гигиены в Ленинградской области и Республике Карелия, в Санкт-Петербургском государственном педиатрическом медицинском университете, в Иркутском Противочумном институте Сибири и Дальнего Востока и Национальном Yersinia референс-центре и Центре сотрудничества с ВОЗ Парижского института Пастера.

Сбор сывороток от больных и здоровых лиц проведен в клинической инфекционной больнице имени С. П. Боткина, Санкт-Петербургском государственном педиатрическом медицинском университете, Окружном военном клиническом госпитале № 442 им. З. П. Соловьева, ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Центре гигиены и эпидемиологии в Республике Бурятия и г. Новый Уренгой, а также лично автором.

Исследования по генотипированию штаммов Y. pseudotuberculosis, сек-венированию участков гена уртА/С проведены автором на базе Парижского института Пастера и ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера в Санкт-Петербурге.

Секвенирование плазмидой ДНК штамма У. pseudotuberculosis IP31758 проведено сотрудниками института геномных исследований, США, в рамках совместного проекта.

Микробиологические, серологические, экспериментальные исследования, систематизация и анализ полученных данных, статистический анализ данных проведен автором в лаборатории бактериальных инфекций ФБУН.

Санкт-Петербургский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера".

Работа выполнялась в рамках тем НИР ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера «Совершенствование технологий эпидемиологического надзора и контроля актуальных инфекций на основе молекулярно-генетических и иммунологических подходов" — отраслевой научно-исследовательской программы «Совершенствование эпидемиологического мониторинга псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза на основе внедрения молекулярно-генетических и современных иммунологических методов исследования» (2011;2015 гг.) — международного проекта ACIP «Молекулярная эпидемиология псевдотуберкулеза в России» (2004;2006 гг.).

Структура и объем диссертации

Основной текст диссертации изложен на 142 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав собственных исследований, заключения, приложений.

Выводы.

1. Методом дот-блот гибридизации у штаммов Y. pseudotuberculosis обнаружены нуклеотидные последовательности плазмиды pVM82, несущей гены вирулентности icm/dot системы секреции IVB типа, umuDC.

2. У штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных на территориях России и Японии, наиболее часто выявлены хромосомные генетические детерминанты вирулентности: ypmA (95,5±1,4%), L-YAPI (70±3,2%) и плаз-мида pVM82 (58,5±3,4%). У штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных на территориях Европы, Северной и Южной Америк, Австралии и Африки наиболее часто выявлены HPI (46,7±4,7%) и L-YAPI (23,8±4%).

3. У штаммов У. pseudotuberculosis различного географического происхождения охарактеризовано 14 генотипов. На территориях Европы, Северной и Южной Америк, Австралии и Африки широко распространены генотипы 2а (НР1+) — 29,3±4,3%, 2Ь (НРГ L-YAPI+) — 10±2,8% и 6а (НРГ урш" УАРГ pVM82″) — 25,8±4,1%, 6b (L-YAPI+) — 9,2±2,7%. На территориях России у изученных штаммов, выделенных их различных источников, выявлено 7 генотипов, доминирующими являются генотипы За (ypmA+) — 21±2,8%, 3b (уртА+ L-YAPI+) — 14,5±2,4% и Зс (уртА+ L-YAPI+ pVM82+) — 55±3,5%.

4. На территориях России распространенность штаммов Y. pseudotuberculosis генотипов 2а и 2Ь (обуславливающих псевдотуберкулез с симптомами мезентериального лимфаденита, острого аппендицита и гастроинтестинальными проявлениями) составляет 6,1±1,7%.

5. На территориях России от больных псевдотуберкулезом выделены штаммы У. pseudotuberculosis генотипов Зс в 60±3,8% случаев, ЗЬ в 17,6±2,9%, За в 16,3±2,8%. Установлена зависимость частоты развития поражений печени и тяжести течения болезни от генотипа возбудителя.

Развитие поражений печени у больных достоверно чаще (р<0,001) в 65,5±8,9% и 57,5±5,3% случаев возникает под влиянием Y. pseudotuberculosis генотипов ЗЬ и Зс по сравнению с Y. pseudotuberculosis генотипа За.

6. Сконструирован отечественный диагностический набор, предназначенный для качественного определения специфических противоиерси-ниозных атител G, М и, А в сыворотке или плазме крови человека методом Лайн-блот для лабораторной диагностики иерсиниозов с острым и хроническим течением. Чувствительность диагностического набора 90,9±2,7%, специфичность 95,2±3,3%.

Практические рекомендации.

1. Для микробиологического мониторинга за псевдотуберкулезом с целью прогнозирования эпидемической ситуации рекомендуется определять основные генетические детерминанты вируленности (ypmA, ypmB, уртС, YAPI, L-YAPI, HPI, R-HPI, pVM82, pYV 46 МДа) и определять генотипы у штаммов Y. pseudotuberculosis, циркулирующих на территории наблюдения, методом дот-блот гибридизации или ПЦР.

2. С целью выявления заболевания, обусловленного штаммами Y. pseudotuberculosis генотипов 2а и 2Ь, рекомендуется проводить диагностические исследования на псевдотуберкулез у больных с симптомами мезентериального лимфаденита, острого аппендицита и гастроинтестинальными проявлениями.

3. Для повышения эффективности этиологической диагностики иерси-ниозов, особенно с хроническим течением заболевания, рекомендуется использовать диагностический набор для определения специфических противоиерсиниозных IgG, IgM или IgA к антигенам патогенных Yersinia методом Лайн-блота.

Перспективы дальнейшей разработки темы.

В дальнейшем планируется продолжить изучение распространения штаммов Y. pseudotuberculosis на не исследованных территориях России с определением генотипа возбудителя псевдотуберкулеза. Необходимо проводить исследования для изучения влияния отдельных генетических детерминант вирулентности на клиническое течение болезни.

Список использованных сокращений.

ДСЛ — Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка ЗИ — Затяжное течение иерсиниозов.

Иммуноблот (А) — Авторский набор для определения IgG, IgM или IgA к антигенам патогенных Yersinia методом Лайн-блота.

Иммуноблот (К) — Коммерческий набор для определения IgG или IgA к антигенам патогенных Yersinia методом Вестерн-блота ИФА — Иммуноферментный анализ НЦМ — Нитроцеллюлозная мембрана ОИ — Острое течение иерсиниозов ОКИ — Острые кишечные инфекции ОСК — Образцы сыворотки крови ПААГ — Полиакриламидный гель ПНР — Полимеразная цепная реакция РА — Реакция агглютинации РНГА — Реакция гемагглютинации ТБР — Трис-HCl буферный раствор ФСБ — Фосфатно-солевой буферный раствор ХИ — Хроническое течение иерсиниозов.

ХС — Раствор хромогенного субстрата (нитроголубой тетразолий хлорид/5-бром-4-хлор-З-индолил-фосфат).

HPI — «Остров» высокой патогенности (High Pathogenicity Island).

IgA — Иммуноглобулины класса А.

IgG — Иммуноглобулины класса G.

IgM — Иммуноглобулины класса М pVM82 — Плазмида с мол. массой 82 МДа pYV 46 МДа — Плазмида вирулентности иерсиний (Plasmid associated with Yersinia virulence).

SDS — Додецилсульфат натрия (Sodium dodecyl sulfate).

Yops — Белки наружной мембраны иерсиний (Yersinia outer membrane proteins).

YAPI — Адгезивный «остров» патогенности иерсиний (Yersinia Adhesion Pathogenicity Island).

YPM — Суперантигенный токсин Y. pseudotuberculosis (Yersinia Pseudotuberculosis Mitogen).