Биохимический синтез сложных эфиров жирных кислот в системе без органического растворителя

Актуальность темы

Обострение проблемы сырьевого обеспечения, необходимость поиска и внедрения более эффективных видов сырья делает актуальным исследование «новых1* нетрадиционных источников получения сложных эфиров жирных кислот (СЗЖК),.

Сложные эфиры жирных кислот представляют собой неионогенные поверхностно-активные вещества (ПАВ), которые используются в различных областях промышленности в качестве пластификаторов, эмульгаторов, диспергаторов, стабилизаторов и др. Они улучшают реологические и косметические свойства кремов и мазей путем стабилизации эмульсий и эффективной гомогенизации многокомпонентных смесей. В пищевой промышленности их применяют при производстве маргарина, в хлебопечении, кондитерском, мыловаренном, сахарном, ликеро-водочном и мясомолочном производствах.

В последние годы неионогенные поверхностно-активные вещества приобретают все возрастающее значение. Самыми крупными потенциальными потребителями их являются нефтяная, химическая и легкая промышленность. Однако, производство неионогенных ПАВ характеризуется высоким расходом сырья и материалов, значительными потерями конечной продукции. Их получают из природного сырья (натуральные ПАВ), химическим, микробиологическим и, в последнее время, биохимическим способом.

Просяная мучка содержит в своем составе липиды, крахмал, белки, витамины и представляет большой интерес, поскольку хорошо известна в пищевой и микробиологической промышленности как источник растительного белка в составе кормовой смеси, как питательная среда, способствующая накоплению значительного количества биомассы.

Способ биохимического синтеза СЭ1К, при котором фермент и один из субстратов (жирные кислоты (ЖК)) локализованы в растительном объекте (просяная мучка) был показан в работах кафедры «Физическая и коллоидная химия» МГУПП (1998 г).

Проведенные ранее исследования позволили определить, что биохимический синтез СЭ1К происходит под действием фермента — липазы, локализованного вместе с жирными кислотами внутри просяной мучки. Разработан метод получения ферментного препарата, обладающего липо-литической активностью, изучена его стабильность. Доказана возможность биохимического синтеза С31К низкои высокомолекулярных спиртов на основе липидов просяной мучки. Показана возможность получения оксиэтилированных сложных эфиров ферментативным синтезом с участием липазы просяной мучки в среде органического растворителя.

Данная работа является логическим продолжением изучения биохимического синтеза СЭ1К под действием липазы просяной мучки на основе липидного комплекса просяной мучки и жирных спиртов, но уже в системе без органического растворителя, так как присутствие в реакционной среде растворителя накладывает на данный способ ограничения, тогда как преимущество реакционной среды, состоящей исключительно из субстратов и фермента очевидно. При этом исключено использование токсичных и дорогих растворителей, которые делают продукты синтеза непригодными, если следы растворителя остаются в них.

Кроме того, было проведено исследование — способна ли липаза этерифицировать не только жирные кислоты, локализованные внутри просяной мучки, но и добавленные в систему, поскольку это позволит синтезировать заменители восков заданного жирнокислотного состава за счет включения желаемых жирных кислот в сложные эфиры.

Помимо этого, необходимо было проследить динамику изменений во времени не только свободных жирных кислот, но и отдельных фракций образованных сложных эфиров. Это возможно только с применением современных физико-химических методов анализа, среди которых предполагалось использовать различные варианты хроматографии и метод радиоактивной метки. о.

В случае неоднородности состава липидного комплекса, метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) является наиболее показательным, т. е. быстро позволяет проследить динамику изменения во времени отдельных фракций синтеза СЭЖК. Однако, в ряде случаев эффективность результатов анализа сложных смесей, содержащих эти вещества (например, йОПОЛЬЬиЬопИс 1 шалЛИп иш1уфил, Чс? Хин/ или мерп и’ермалия) не отвечает задачам исследования. Повышения эффективности хрома-тографических методов может быть достигнуто на основе более широких исследований методического характера. Главная задача при этом состоит в повышении эффективности метода ТСХ и расширением его аналитических возможностей (отечественные пластины, использование пластин с привитыми фазами). Повышение эффективности разделения сложных смесей липидов, очевидно, можно добиться как путем более полного использования индивидуальных хроматографических методов, так и путем их комбинирования.

В связи с этим очевидна актуальность задачи исследования биохимического синтеза СЭЖК с участием липазы и жирных спиртов в системе без органического растворителя и разработке надежных хромато-графических методов анализа.

Цель работы. Целью настоящей работы является исследование возможности проведения биохимического синтеза СЭЖК под действием липазы просяной мучки в системе без растворителя и изучение способности липазы просяной мучки этерифицировать не только жирные кислоты, локализованные в ней самой, но и добавленные искусственно, как свободные, так и в составе триацилглицеридов, что позволит получать заменители восков заданного жирнокислотного состава.

При этом необходимо было решить следующие конкретные задачи:

— исследовать условия проведения ферментативного синтеза СЭЖК в системе без органического растворителя;

— изучить кинетические характеристики ферментативного синтеза.

СЭ1К в системе без органического растворителя;

— исследовать возможность получения восков заданного жирнокислот-ного состава за счет включения желаемых жирных кислот в зфиры;

— подобрать элюирующие системы для метода ТСХ на новых отечественных пластинах, обеспечивающих эффективное разделение анализируемых веществ:

— разработать комплексный метод определения изучаемых соединений на основе гибридизации методов ТСХ и ВЭЖХ.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые показана возможность осуществления биохимического синтеза СЭЖК, при котором используется фермент, локализованный вместе с одним из субстратов (жирными кислотами) непосредственно в растительном объекте (просяной мучке) в среде, не содержащей органического растворителя. Подобраны оптимальные условия проведения синтеза СЭЖК в системе без растворителя, где переменными параметрами были: температура, время инкубирования, концентрация субстратов. Впервые установлено, что липаза просяной мучки способна этерифицировать не только жирные кислоты, локализованные в ней самой, но и добавленные искусственно. Область применения — использование в биотехнологии для синтеза восков с желаемыми включениями жирных кислот и жирного спирта. Впервые исследованы закономерности удерживания 1К и СЭ1К на отечественных пластинах «Сорбтон», что позволило проследить динамику изменения этих фракций в сложной биологической массе. Подобраны оптимальные условия для определения методом ВЭЖХ динамики накопления СЭЖК в исследуемых объектах.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1,1 Краткая характеристика неионогепных поверхпостно-актв-ных веществ, в частности, СЭШ и их приметит в косметике.

Характерной особенностью современного производства косметических продуктов является его лечебно-профилактическое направление при создании препаратов, содержащих вещества, активно действующих на кожу. Сегодня лекарственные растения как биологически-активные вещества, находят широкое применение в косметических препаратах. [3.14,68,73].

Среди сырьевых веществ, используемых в косметике, липиды занимают одно из главных мест. Долгое время применяли наиболее легко доступные животные жиры и растительные масла, такие как свиное сало и жир, пальмовое, оливковое и миндальное масла. Они состоят из триацилглицеридов высших насыщенных (лауриновая, миристиновая, пальмитиновая, стеариновая) и ненасыщенных (олеиновая, линолевая, линоленовая) жирных кислот. Этот химический состав в значительной степени опоеделяет легкость проникновения их в волосяной фолликул и верхние слои эпидермиса. В связи с этим они являются самыми подходящими основами питательных и в меньшей степени защитных кремов. [8,68].

Отрицательным свойством липидов является их способность к окислению и прогорканию, связанная с ненасыщенным характером триацилглицеридов жирных кислот. Продукты этих процессов — альдегиды, кетоны и жирные кислоты — оказывают раздражающее действие на кожу и слизистые оболочки. Эти процессы задерживаются путем гидрогенизации ненасыщенных жирных кислот, однако, при этом распадаются витамины О, Р и Е. [8,68].

Важное значение имеют эфиры жирных кислот с одноатомными спиртами — изопропилмиристат, изопропилпальмитат, изопропиллаури-нат. легко проникающие в кожу и непрогоркающие. [8,68].

Наиболее часто в косметике используют углеводороды (вазелин, парафин, церезин и др.), воски, представляющие собой сложные эфи-ры высших жирных кислот с одноатомными, реже двухатомными спиртами. Также воски содержат свободные жирные кислоты, свободные спирты, стерины и др. Из натуральных восков для косметики важны пчелиный воск, спермацет, ланолин, [9,141.

Спермацет — воск, получаемый из жира особых полостей черепа кошалота. Твердая, белая, жирная на ощупь масса с перламутровым блеском и температурой плавления 45−54 ° С. В отличие от жира, спермацет не оставляет на бумаге жирных пятен и мало подвергается прогорканию. Добавленный в крема спермацет, придает им более плотную консистенцию и эмульсионные свойства, вследствие чего применяется для смягчающих, охлаждающих кремов и губной помады. [68] За последние годы произошло резкое сокращение добычи кошало-тов, что ограничивает ресурсы получения спермацета. Спермацет рассматривается как один их дефицитнейших видов косметического сырья.

Ланолин — жироподобное вещество, получаемое путем промывания овечьей шерсти в мыльной воде или экстракцией органическими растворителями. Не разлагается, не раздражает кожу человека и хорошо всасывается. Очищенный ланолин представляет собой смесь жиров и восков, содержащих холестерин, Ланолин, обладающий большой гидро-фильностью, поглощает значительное количество воды (около 150%), не теряя при этом мазеобразной консистенции, поэтому широко применяется в косметике для приготовления кремов и охлаждающих мазей. [68,751.

Пчелиный воск вырабатывается восковыми железами пчел и выделяется в виде тончайших пластинок. Пчелиный воск, отбеленный на солнце белый воск быстро прогоркает, поэтому белый воск консервируют тут же после отбеливания. [68,75].

Все рассмотренные воски природного происхождения — это прежде всего с,.ножные эфиры высших жирных кислот и высокомолекулярных спиртов. Как уже указывалось выше, в связи с дефицитом восков природного происхождения в косметической промышленности, получают искусственные воска на основе сложных эфиров жирных кислот (пальмитиновой и стеариновой) и высокомолекулярных алифатических спиртов, содержащих двенадцать и более атомов углерода, а также смеси полиэтиленгликолей с молекулярным весом 300, 500 и 600. Синтетические воска служат дешевым заменителем дорогостоящих природных восков, обладают эмульгирующей способностью и поэтому могут быть использованы в качестве основного или вспомогательного эмульгатора в составе кремов, лосьонов, препаратов для бритья, декоративных косметических изделий. Поскольку природные продукты представляют собой смеси, содержащие большое количество различных органических соединений, а современная промышленность стремится производить изделия постоянного качества, поэтому устойчивые синтетические вещества заметно потеснили собственно натуральные. [3,593 Использование синтетических поверхностно-активных веществ (ПАВ), к которым относятся сложные эфиры жирных кислот, позволит не только восполнить дефицит природного сырья, источники которого ограничены, но и достигнуть большего разнообразия свойств изготовляемой продукции. [22,50,60].

ПАВ широко используются не только в косметическом производстве, но и в других отраслях промышленности. Так например, неионо-генные ПАВ находят применение в качестве жирующих препаратов в кожевенном производстве. В нефтеперерабатывающей и нефтехимической промышленности их используют в качестве эмульгаторов и деэ-мульгаторов. Применение неионогенных ПАВ в лакокрасочной промышленности и производстве химических волокон, позволяет значительно интенсифицировать технологические процессы. Широкое применение находят ПАВ в пищевой промышленности, кондитерском производстве, мыловарении, сахарном, ликеро-водочном и мясомолочном производствах. [1,10, 17, 20, 50, 51, 58, 613.

В настоящее время существует также необходимость в дополнительных источниках получения восков и это может быть осуществлено с помощью биотехнологии. С тех пор, как в 1971 году вышел запрет на импорт каша/ютового жира, изыскиваются новые источники получения восков. Наибольшее внимание исследователей было сконцентрировано на масле Жожоба, основными компонентами которого являются (в % от суммы): сложные эфиры — эйкозенилолеат (5.7%), эйкозенилэй-козеноат (28%), свободные жирные кислоты присутствуют в количестве 100 мг на 1 кг воска. Однако, попытки увеличить продуктивность этого растения посредством агрономии и селекции находятся пока в развитии: необходимо 10−12 лет, прежде чем новые растения дадут урожай. [102].

В тоже время роль растительных масел как сырья для химической промышленности неуклонно увеличивается, поскольку растительные масла относятся к возобновляемым ресурсам, производство которых ежегодно увеличивается. [93] Продукты, получаемые из природных источников, являются более ценными для применения в пищевой, медицинской и косметической промышленностях. Использование растительных масел в масложировом производстве объясняется их высокой способностью ко вступлению в реакции с другими веществами и возможностью получения из них жирных кислот и их производных (метиловых эфиров, ацилглицеридов, жирных спиртов).

В Германии продолжительное время ведутся исследовательские работы в лабораторных и производственных условиях с целью расширения границ применения растительного и рапсового масел, причем с возможностью приготовления из них новых полуфабрикатов. При этом отмечается необходимость создания новых технических и технологических способов производства. С91].

Растительные масла содержатся также в косточках некоторых плодовых деревьев (абрикос, персик, вишня, миндаль), семенах винограда, арбуза, томатов, табака, чая, а также в различных масло-содержащих отходах пищевых производств, перерабатывающих сельскохозяйственное сырье. К последним относятся главным образом отруби и зародыши семян зерновых культур. В оболочке зерна пшеницы и ржи содержится 5−6% масла, в зародыше -11−13% и 10−17% соответственнов зародыше кукурузы — 30−40% масла, проса — около 27%, риса -24−25%. Содержание масла и его качество зависят от сорта растения, условий произрастания (у/добрение, обработка почвы), степени зрелости плодов и семян. 108] Растительные масла на 94−96% состоят из смесей триацилглицеридов высших жирных кислот. Оставшуюся часть составляют фосфолипиды, стерины, витамины, свободные жирные кислоты и др. Свободные жирные кислоты могут содержатся в растительном сырье (семена недозревших растений или семена, самосозревающие при хранении во влажном состоянии) или образовываться в процессе выделения масла в результате частичного гидролиза триацилглицеридов. [76,108,109].

Свойства растительных масел определяются главным образом составом и содержанием жирных кислот, образующих триацилглицери-ды. Обычно это насыщенные и ненасыщенные одноосновные жирные кислоты с неразветвленной углеродной цепью и четным числом атомов углерода. Кроме того, в растительных маслах обнаружены в небольших количествах триацилглицериды жирных кислот с нечетным числом атомов углерода. [76].

Растительные масла являются источником ненасыщенных незаменимых жирных кислот — линолевой, линоленовой и арахидоновой. [76] Растительные масла используют в основном для пищевых целей. Масла подсолнечное, хлопковое, соевое, арахисовое потребляются непосредственно в пищу в натуральном, рафинированном или гидрированном (маргарин) виде, вводятся в состав майонезов, соусовприменяются в производстве овощных и рыбных консервов, шоколада (масло-какао), кремов, халвы и др. кондитерских изделиях. Растительные масла используются также для разбавления красок, размягчения эмульсионных грунтов и масляных лаков. Высыхающие маслаосновное сырье в производстве пленкообразователей (олиф, лаков). Натуральные и гидрированные масла — важнейшие компоненты в производстве туалетного и хозяйственного мыла, косметических средств, составов для обработки кожи. [67] В медицинской практике жидкие растительные масла (касторовое, миндальное, подсолнечное) применяют при производстве лекарственных мазей. [76,78,80].

ВЫВОДЫ.

1.Впервые доказана принципиальная возможность биохимического синтеза СЭЖК на основе липидного комплекса просяной мучки под действием липазы просяной мучки в системе без органического растворителя.

2. Экспериментально установлено, что ферментативная реакция этерификации на основе липидного комплекса просяной мучки в системе без органического растворителя является реакцией второго порядка. Рассчитаны константы скоростей реакции при различных температурах синтеза.

3. Показано, что при увеличении температуры синтеза, константа скорости ферментативной реакции этерификации на основе липидного комплекса просяной мучки в системе без органического растворителя увеличивается и достигает максимального значения при 60° С.

4. Исследованы условия проведения ферментативного синтеза СЭЖК на основе липидного комплекса просяной мучки в системе без растворителя.

5. Показана избирательная способность липазы просяной мучки к селективному включению жирных кислот в сложные эфиры в зависимости от их степени ненасыщенности в системе без органического растворителя.

6. Показана возможность проведения ферментативного синтеза СЭЖК под действием липазы просяной мучки в системе без органического растворителя из добавленных жирных кислот для получения вос-ков с желаемыми включениями жирных кислот.

7. Доказана возможность получения СЭЖК с желаемыми включениями жирных кислот из триацилглицеридов жиров и масел с помощью реакции переацилирования с использованием липазы просяной мучки в системе без органического растворителя.

8. Исследованы особенности хроматографического разделения жирных кислот в режиме адсорбционной и распределительной хроматографии методом ТСХ на пластинах фирмы Мерк и отечественных пластинах Сорбтон, Сорбтон Диол, Сорбтон РР2. Установлено, что пластины отечественного производства Сорбтон КР2 по разделительным свойствам близки к пластинам фирмы Мерк.

9. Определен оптимальный состав элюирующих систем для разделения свободных жирных кислот, а именно- 100% ацетонитрил с добавлением 1% воды и для разделения СЭ1К, а именно- 65% ацетонитрил — 35% ацетон методом ВЗЖХ.