Разработка метода специфической детекции и видовой дифференциации возбудителей хламидиозов на основе структурного полиморфизма гена отр2

Создание простого и удобного метода специфической детекции и видовой дифференциации хламидий — одна из наиболее актуальных задач современной хламидиологии. Впечатляющее количество научных работ, посвященных этой тематикелучший критерий необходимости подобной системы для нужд фундаментальной и клинической микробиологии. Высокая значимость хламидий как патогена определяет высокую (особенно в последние годы) скорость накопления новых знаний о биологическом разнообразии и генетике этих организмов. Результатом этого является существенное увеличение за последнее десятилетие числа идентифицированных видов в семействе Chlamydiaceae. Так, если в 1993 году после добавления нового вида Chlamydia ресогит (ныне Chlamydophila ресогит) общее число известных видов хламидий достигло 4-х, то предложенная в 1999 году таксономия определяет уже 9 видов этих организмов.

Таким образом, решение вопросов видовой дифференциации хламидий, ранее сталкивавшееся только с проблемами, связанными со сложностью изучения объекта и недостаточной степенью изученности геномов хламидий, в настоящее время усложняется еще и необходимостью пересмотра методических критериев и приемов, разработанных на более ранних этапах исследований, в соответствии с требованиями современной систематики. Это коснулось ряда систем, которые были предложены для видовой дифференциации хламидий в середине-конце 90-х годов, и которые во многом потеряли свою специфичность и способность к типированию современных видов хламидий после изменения классификации семейства Chlamydiaceae. В частности, в работе группы японских ученых под руководством др-H.Yoshida была предложена система дифференциации всех видов хламидий, основанная на ПЦР-амплификации фрагмента гена ompl и последующим анализе ПДРФ ампликона, обработанного рестриктазой Alul. Согласно положениям существовавшей тогда классификации эта система позволяла дифференцировать большинство штаммов представителей четырех видов хламидий, однако изменение таксономии и появление новых видов в составе семейства Chlamydiaceae сделало невозможным ее применение для генотипирования современных видов хламидий.

Публикация в 1999 году в International Journal of Systematic Bacteriology работы «Emended description of the order Chlamydiales, proposai of Parachlamydiaceae fam. nov. and Simkaniaceae fam. nov., each containing one monotypic genus, revised taxonomy of the family Chlamydiaceae, including a new genus and five new species, and standards for the identification of organisms», авторами которой были известные специалисты по молекулярной генетике хламидий Katrin D. Everett, Robin M. Bush, Arthur A. Andersen ознаменовала изменение таксономии представителей Chlamydiaceae на основе анализа нуклеотидных последовательностей рибосомальных генов. Одновременно с вышеупомянутой, была опубликована работа тех же авторов под названием «Identification of nine species of the Chlamydiaceae using PCR-RFLP», в которой была описана методика генотипирования всех видов хламидий путем амплификации фрагмента рибосомального оперона размером 600 пар нуклеотидов с дальнейшим анализом ПДРФ, полученных при обработке ампликонов рестриктазами Bfal, Cfsl, Hpal, Bell, Ddel, Acil и Rsal. При всей несомненной значимости этой работы для фундаментальной хламидиологии, описанный способ молекулярно-генетической идентификации видов хламидий, конечно, не может стать инструментом для практического генотипирования хламидий ввиду дороговизны и технической сложности постановки эксперимента и интерпретации результатов рестрикционного анализа. Кроме того, система ПЦР-амплификации фрагмента рибосомального оперона, предложенная в этой работе, не являлась специфичной только для представителей сем. Chlamydiaceae, т.к. обеспечивала наработку ампликона сходного размера на ДНК-матрице Simkania negevensis и нескольких ампликонов различного размера на матрице Legionella pneumoniae и Mycoplasma orale.

Таким образом, до последнего времени не было предложено ни одного практического метода специфической идентификации и типирования всех девяти видов хламидий, которые не прибегали бы к техникам секвенирования или рестрикционного анализа с применением значительного количества различных рестриктаз. Даже появившаяся недавно работа группы английских ученых под руководством JC Hartley, «PCR detection and molecular identification of Chlamydiaceae species», которая, несомненно, является значительным шагом к разрешению поставленной проблемы, не решает ее до конца и в полном объеме по причине необходимости применения ряда дополнительных методов для дифференциации С.ресогит.

В сложившейся ситуации расширение исследований генетической вариабельности хламидий и создание надежного и простого метода практической идентификации и дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae является актуальной задачей фундаментальной и практической микробиологии.

2. Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы было изучение структурных особенностей генов хламидий и создание простого и надежного метода специфической детекции и видовой дифференциации представителей всех видов семейства Chlamydiaceae, основанного на методе амплификации ДНК генома хламидий с последующим анализом структурного полиморфизма полученных ПЦР-ампликонов.

Для достижения поставленной цели нами был определен ряд задач:

1. На основе компьютерного анализа известных нуклеотидных последовательностей генов хламидий провести выбор оптимальной генетической мишени для разработки метода видовой дифференциации хламидий.

2. Создать банк рекомбинантных плазмид, содержащих выбранную в качестве мишени область ДНК референс-штаммов всех видов семейства Chlamydiaceae.

3. Определить нуклеотидные последовательности выбранной генетической мишени у тех видов хламидий, для которых она не известна.

4. Провести анализ вариабельности нуклеотидной последовательности выбранной генетической мишени у всех видов Chlamydiaceae.

5. Разработать систему ПЦР обеспечивающую специфическую амплификацию маркерной области генетической мишени у всех видов семейства Chlamydiaceae.

6. Разработать метод видовой генетической дифференциации видов хламидий основанный на видовом своеобразии нуклеотидных последовательностей выбранной генетической мишени.

7. Апробировать методику специфической детекции и видовой дифференциации на коллекции изолятов хламидий.

3. Научная новизна и практическая значимость работы.

1. Впервые определены нуклеотидные последовательности около 97% гена отр2 Chlamydia suis и Chlamydophila felis. Определенные последовательности заложены в Банк нуклеотидных последовательностей GenBank.

2. Клонированы в клетках E. coli значащие участки (около 97%) гена отр2 представителей всех 9 видов семейства Chlamydiaceae.

3. Разработан оригинальный способ детекции представителей семейства Chlamydiaceae методом ПЦР-амплификации.

4. Разработан новый для клинической микробиологии методический подход для оценки генетической вариабельности микроорганизмов, основанный на электрофоретическом анализе рестриктов ПЦР-продуктов в агарозном геле, содержащем специфический ДНК-связывающий лиганд.

5. Разработан метод идентификации и дифференциации видов семейства СМатусИасеае в соответствии с современной таксономией СМатусИасеае. Метод позволяет в короткие сроки и без существенных материальных затрат проводить идентификацию и видовую дифференциацию штаммов хламидий и может использоваться для определения видовой принадлежности культивируемых хламидий, оценки соответствия контрольных штаммов хламидий паспортным данным, генотипирования имеющихся музейных штаммов в соответствии с новой таксономией семейства СМатусИасеае, а также для решения других задач клинической микробиологии.

6. С помощью разработанного метода проведено генотипирование и установлена видовая принадлежность штаммов хламидий, полученных из коллекции ГУ Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.

ВЫВОДЫ:

1. Показано, на основании компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей ряда генов хламидий, что ген отр2 является оптимальной генетической мишенью для видовой дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae.

2. Создан банк рекомбинантных плазмид, содержащих ген отр2 референс-штаммов всех видов семейства Chlamydiaceae.

3. Определены ранее неизвестные нуклеотидные последовательности гена отр2 С. suis и C.felis. Последовательности заложены в Банк нуклеотидных последовательностей GenBank.

4. Показано, на основании проведенного анализа межвидовой вариабельности нуклеотидной последовательности гена отр2 хламидий, что степень гомологии между различными видами семейства Chlamydiaceae колеблется в пределах от 46.3 до 85.9%.

5. Построено филогенетическое древо семейства Chlamydiaceae на основе нуклеотидной последовательности гена отр2. Подтверждено, на основании проведенного филогенетического анализа, эволюционное родство между видами семейства Chlamydiaceae, определенное ранее на основании изучения генов рибосомального оперона и гена отр! хламидий.

6. Разработан оригинальный метод специфической детекции представителей семейства Chlamydiaceae, основанный на ПЦР-амплификации участка гена отр2.

7. Разработан новый для клинической микробиологии методический подход для оценки генетической вариабельности микроорганизмов, основанный на электрофоретическом анализе ПЦР-продуктов или их рестриктов в агарозном геле, содержащем специфический ДНК-связывающий лиганд.

8. Разработан оригинальный метод видовой дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae, основанный на анализе полиморфизма длин ЛзаГ-рестрикционных фрагментов отр2-ампликонов.

9. Разработанный метод специфической детекции и видовой дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae позволяет проводить оценку видовой принадлежности культивируемых хламидий, оценку соответствия контрольных штаммов хламидий паспортным данным, генотипирование имеющихся контрольных штаммов в соответствии с новой таксономией семейства Chlamydiaceae, а также для решения других задач клинической микробиологии.

10. Проведено, с помощью разработанного метода, генотипирование и установлена видовая принадлежность штаммов хламидий из коллекции ГУ Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН. Показано соответствие полученных результатов данным об источнике выделения изолята и клинической картине заболевания организма-хозяина, а также их корреляция с результатами, полученными при анализе коллекции рядом альтернативных ПЦР-систем.

Автор выражает глубокую благодарность д.б.н. С. С. Ямниковой (ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН) за предоставление коллекции хламидийных изолятов, а также к.б.н. М. В. Эйдельштейна и И. А. Эйделынтейн (НИИ антимикробной химиотерапии СГМА) за сотрудничество и помощь в работе.

3.8.

Заключение

.

В настоящее время, в связи с широкой распространенностью заболеваний, вызываемых хламидиями, значительным разнообразием их клинических проявлений, особенностями биологии, трудностями культивирования возбудителя, а также кардинальным изменением филогенетической структуры семейства СМатусИасеае разработка простого и надежного метода специфической детекции и видовой дифференциации возбудителей хламидиозов является насущной задачей клинической микробиологии.

Большинство иммунноферментных и молекулярно-генетических методов, позволяющих проводить детекцию и дифференциацию хламидий, использовавшихся до недавнего времени, в настоящее время не удовлетворяют требованиям идентификации всех видов представителей семейства СЫатусИасеае, что является необходимой процедурой при культивировании этих микроорганизмов, получении чистых культур и создании музея хламидийных штаммов, получении контрольных штаммов для диагностических препаратов.

В то же время, существующие в настоящее время методики, позволяющие решать эти задачи требуют значительных временных и материальных затрат или использования дорогостоящего оборудования.

Для решения задачи создания системы, позволяющей проводить специфическую детекцию и видовую дифференциацию возбудителей хламидиоза, был проведен анализ вариабельности нуклеотидной последовательности всех сколь-либо значительно изученных генетических локусов представителей всех видов семейства СМатусИасеае в результате которого в качестве оптимальной ДНК-мишенью был признан ген отр2, кодирующий белок наружной мембраны (Отр2) ЭТ хламидий. В процессе выполнения работы определены ранее неизвестные нуклеотидные последовательности этого гена у двух видов хламидий.

Построено филогенетическое дерево семейства СМатусИасеае на основе нуклеотидной последовательности гена отр2. Подтверждено, на основании проведенного филогенетического анализа, эволюционное родство между видами семейства СЫатусИасеае, определенное ранее на основании изучения других генетических мишеней хламидий.

Разработан оригинальный метод специфической детекции и межвидовой дифференциации представителей семейства СМатусИасеае, основанный на ПЦР-амплификации специфического участка гена отр2 и анализе полиморфизма длин и нуклеотидного состава рестрикционных фрагментов полученных ПЦР-ампликонов с использованием нового для клинической микробиологии методического подхода для оценки генетической вариабельности микроорганизмов. Предложенный методический подход основан на электрофоретическом анализе ПЦР-продуктов или их рестриктов в агарозном геле, содержащем специфический ДНК-связывающий лиганд.

Разработанный метод успешно апробирован на коллекции хламидийных изолятов, при этом результаты генотипирования изолятов коллекции полностью соответствуют результатам тестирования коллекции изолятов в альтернативных ПЦР-системах, обладающих различной специфичностью. Кроме того, полученные результаты хорошо коррелировали с данным об источнике выделения изолята и клинической картине заболевания организма-хозяина.

В результате проведенных исследований получено авторское свидетельство на изобретение № 2 205 876 от 10.06.03 «Способ диагностики хламидийной инфекции (варианты)».