Исследование роли рибосомных белков L5 и L25 в формировании функционально-активной бактериальной рибосомы

В клетках всех живых организмов белки синтезируются на рибосоме. ' Исследование структуры, функции и эволюции рибосомы интенсивно ведутся с 50* гг. XX века. За этот период накоплен огромный экспериментальный материал о структуре рибосомы и ее компонентов, а также о принципах ее функционирования. Однако, несмотря на это, остается еще много нерешенньгс вопросов относительно деталей протекания отдельных стадий трансляции и роли компонентов рибосомы в этом процессе. Кроме того, несмотря на недавние успехи в определении пространственной структуры рибосомы, далеко не все ясно относительно принципов специфического взаимодействия РНК и белков, лежащих в основе ее структурной организации. Об этом свидетельствует то, что количество работ, посвященных рибосоме, только возрастает. Кроме того, большая часть имеющихся на сегодняшний день данных получена в экспериментах in vitro, которые далеко не всегда могут адекватно отражать процессы, происходящие в клетке.

Рибосомы ныне живущих организмов состоят из двух неравных субьединиц (малой и большой). Одной из самых характерных морфологических особенностей большой рибосомной субчастицы любого организма является центральный протуберанец. Известно, что центральный протуберанец участвует в ассоциации рибосомных субчастиц (Lake, 1976), а у его основания расположены пептидилтрансферазный центр и тРШС-связывающие участки рибосомы (Barta et al., 1984; Moazed & Noller, 1989; Yusupov et al., 2001; Nissen et al, 2000; Selmer et al., 2006). Большую часть этого структурного элемента рибосомы формирует комплекс 5S рРНК и нескольких специфически связывающихся с ней рибосомных белков. В экспериментах in vitro было показано, что в отсутствие 5S рРНК-белкового комплекса собирается функционально неактивная большая субчастица рибосомы (Erdmann et al., 1971; Dohtne & Nierhaus, 1976b). Однако прямых данных о том, для чего нужен этот комплекс в рибосоме, до сих пор нет. Количество белков, специфически связывающихся с 5S рРНК, варьирует в разных организмах. В Escherichia coli — это три белка, L5, L18 и L25. Белки L5 и L18 обнаружены в рибосомах представителей всех доменов жизни, Бактерий, Архей и Эукариот (Gasteiger et al., 2003; Benson et al., 2008). В то же время, рибосомный белок L25 является особенностью бактерий — ген этого белка не обнаружен в известных геномах архей и эукариот. Недавно было продемонстрировано, что белки L5 и LI8 строго необходимы для выживания бактериальной клетки Е. coli (Korepanov et al., 2007). В то же время, при нокауте гена белка L25 клетки выживали, но росли медленнее, чем клетки исходного штамма, а Ь25-дефицитные рибосомы отличались сниженной эффективностью в синтезе природных полипептидов. Таким образом, все имеющиеся данные указывали на то, что 5S рРНК-связывающиеся белки чрезвычайно важны для функционирования бактериальной рибосомы. Однако их конкретная роль в формировании рибосомы в клетке оставалась невыясненной. В связи с этим, в рамках данной работы были проведены исследования, посвященные выяснению роли рибосомных белков L5 и L25 в сборке и функционировании рибосомы Е. coli.

В первой части работы были проведены детальные исследования особенностей взаимодействия 5S рРНК с белком L25 Е. coli и его гомологом, рибосомным белком TL5 Thermus thermophilic. Для этого был осуществлен направленный мутагенез аминокислотных остатков этих белков, образующих водородные связи с РНК в комплексе. Было установлено, что пять идентичных остатков в белках L25 и TL5, формирующих их 5S рРНК-связывающий модуль, чрезвычайно важны для стабилизации уже сформированного РНК-белкового комплекса. Выявленные принципы взаимодействия этих белков с изолированной 5S рРНК позволили перейти к изучению данного взаимодействия в системе in vivo. Для этого был создан ряд штаммов Е. coli, содержащих мутантную форму белка L25, лишенную способности связываться с 5S рРНК in vitro. Были изучены ростовые характеристики клеток указанных штаммов, а также эффективность встраивания мутантной формы белка L25 в рибосому in vivo. Полученные данные впервые демонстрируют необходимость образования прочного контакта между белком L25 и 5S рРНК для удержания данного белка в рибосоме, а таюке для стабильной ассоциации рибосомных субчастиц.

Во второй части работы было проверено, какой эффект на сборку большой рибосомной субчастицы оказывает отсутствие жизненно важного рибосомного белка L5 в клетках Е. coli. Впервые были получены и охарактеризованы большие рибосомные субчастицы, собранные in vivo в отсутствие этого белка. Установлено, что такие субчастицы лишены большей части компонентов ее центрального протуберанца. Кроме того, в данной работе было исследовано влияние мутаций в контактирующей с тРНК в петле ?2-?3 белка L5 на функциональные свойства рибосом. Было показано, что в отличие от замены отдельных аминокислотных остатков делеция сразу нескольких остатков в указанной петле белка приводит к снижению эффективности функционирования рибосомы Е. coli и, как следствие, замедлению роста клеток этой бактерии.

Полученные результаты и методы, изложенные в работе, могут быть использованы не только при изучении рибосомы и ее компонентов, но и в других областях молекулярной биологии при структурно-функциональных исследованиях комплексов нуклеиновых кислот с белками.

ВЫВОДЫ.

1. Из результатов комплексных исследований 5S рРНК-связывающих свойств рибосомного белка L25 Escherichia coli и его гомолога, белка TL5 Thermus thermophilus, следует, что:

• пять аминокислотных остатков — R10/9, R19/21, Y29/31, Н85/88, D87/90 в TL5/L25, формирующих РНК-связывающий модуль этих белков, чрезвычайно важны для стабилизации их комплекса с изолированной 5S рРНК;

• формирование прочного контакта между белком L25 и 5S рРНК не является обязательным условием для встраивания этого белка в рибосому in vivo. В то же время, этот межмолекулярный контакт необходим для прочного удержания белка L25 в рибосоме и стабильной ассоциации рибосомных субчастиц.

2. Доказано, что немногочисленные случаи одновременных природных изменений в контактирующих областях белка семейства СТС и 5S рРНК представителей класса Bacilli и типа Cyanobacteria имеют компенсаторный характер и направлены на сохранение этими молекулами способности формировать стабильный комплекс.

3. Установлено, что белок СТС Aquifex aeolicus обладает полноразмерным 5S рРНК-связывающим доменом и, таким образом, не является исключением среди белков данного семейства.

4. Впервые показано, что рибосомный белок L5 Е. coli строго необходим для встраивания 5S рРНК-белкового комплекса, а также белков L16, L27, L30 и L33 в большую субчастицу рибосомы in vivo. Из полученных данных следует, что белок L5 прямо или опосредованно влияет на формирование целого структурно-функционального домена (центрального протуберанца) бактериальной рибосомы.

5. Показано, что рибосомы Е. coli, содержащие белок L5 с укороченной петлей р2-рЗ, менее эффективно синтезируют природные полипептиды. Сниженная функциональная активность данных рибосом не связана с увеличением частоты ошибок трансляции.