Церулоплазмин: от метаболита до лекарственного средства

Церулоплазмин (ЦП) — медьсодержащая феррооксидаза (КФ.1.16.3.1). Ген ЦП расположен на хромосоме 3— 3q23q24. Молекула ЦП представляет собой в-глобулин, составную часть альфа-2-глобулиновой фракции плазмы крови человека. Этот белок насчитывает 1046 аминокислотных остатков с M_r 132 кДа, содержит 6 доменов и вместе с 6 ионами меди образует тригональную структуру.

Согласно современным данным, у этой медьсодержащей оксидазы ионы меди представлены тремя типами. Ион меди первого типа имеет пик оптического поглощения при 610 нм и определяет интенсивный голубой цвет ферментов данного класса, поэтому их часто называют «голубыми» белками. С ионами меди первого типа взаимодействуют два азота гитидина, SH-группа цистеина и остаток метионина — вместе они формируют координационную сферу ионов меди. Ион меди второго типа имеет типичный ЭПР_спектр двухвалентной меди и не вносит вклада в оптические спектры медьсодержащих оксидаз. Два иона меди третьего типа образуют биядерный медный комплекс с максимумом поглощения 330 нм. Ион меди второго типа и два иона третьего типа образуют «трехъядерный кластер» — лигандами этого трехъядерного комплекса являются 8 остатков гистидина, расположенных в 4-х консервативных аминокислотных последовательностях. В шестидоменной структуре оксидазы домены 2, 4 и 6 содержат по одному иону меди 1-го типа. За характерный «голубой» цвет молекулы ЦП ответственны ионы 1-го типа, локализованные в доменах 4 и 6 и связанные с остатками метионина. В домене 2 с ионом меди связан лейцин ван-дер-ваальсовыми силами.

Трехъядерный кластер в молекуле ЦП формируется доменами 1 и 6, причем ионы меди связаны с четырьмя остатками гистидина в первом домене и с четырьмя в шестом. Трехъядерный кластер и ион меди 1-го домена формируют оксидазный центр церулоплазмина. Структурное сходство этого центра с активными центрами других медьсодержащих оксидаз объясняет оксидазное действие ЦП, обеспечивающее его ферроксидазную и антиоксидазную активность.

Известны две изоформы церулоплазмина человека, каждая из них — это сывороточный гликопротеин, представленный одной полипептидной цепью. Углеводный компонент ЦП (2−8% от массы молекулы) включает 9 олигосахаридных цепей, содержащих глюкозамин (15,7−19,2%), маннозу (14,2%), галактозу (12,3%), фукозу (1,6%), сиаловые кислоты (8,6%). Медь составляет 0,27−0,32% от всей массы белка. Биосинтез ЦП происходит в гепатоцитах. Первичный продукт трансляции ЦП (80 кДа) в гладком эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи подвергается посттрансляционной модификации, включающей ограниченный протеолиз.

Из образованного таким образом предшественника (65 кДа) в результате сшивки образуется молекула ЦП (132 кДа), которая поступает в кровяное русло. Затем ЦП, после связывания со специфическими рецепторами на поверхности клеток организма и передачи этим клеткам части ионов меди, подвергается интернализации с помощью рецептор_опосредованного эндоцитоза. При этом пептидная часть молекулы ЦП теряет остатки сиаловых кислот и освобождается в кровоток. Гепатоциты захватывают ЦП и связанную с ней медь и выводят эту деградированную молекулу в желчь.

Молекулярная масса ЦП у разных видов различна и колеблется в пределах 130−138 кДа. Имеются данные о генетическом полиморфизме ЦП и о его электрофоретических вариантах у разных этнических групп.

Основным источником синтеза ЦП в организме является печень. Однако и некоторые другие ткани также способны его вырабатывать. Обнаружена экспрессия гена ЦП в лимфоцитах, в мононуклеарных клетках селезенки, в тканях мозга, в бронхах, в клетках эндометрия матки. ЦП был выявлен в клетках легких на всем протяжении воздухоносных путей и в альвеолах, причем, при воспалительном процессе его уровень в клетках бронхиального эпителия, особенно крупных бронхов, резко возрастал.

Основное количество ЦП содержится в плазме крови и составляет 300−580 мг/л. Кроме того, ЦП присутствует также в синовиальной жидкости и в мышечных тканях. Рецепторы к ЦП обнаружены на купферовских клетках, фибробластах, астроцитах, эритроцитах, лейкоцитах и моноцитах, мембранах клеток аорты и кардиомиоцитов. Такая распространенность рецепторов указывает на важную роль ЦП в организме. Процессы, в которых участвует ЦП, имеют как ферментативную, так и неферментативную природу. Среди многообразных функций ЦП в настоящее время могут быть выделены следующие основные: 1) транспорт и регулирование оборота меди в крови и органах; 2) феррооксидазное действие и иммобилизация сывороточного железа; 3) антиоксидантное действие; 4) участие в острофазных реакциях; 5) регуляция уровня биогенных аминов в организме.

Медь — это необходимый элемент для многих биологических процессов. Функциональный диапазон ее весьма широк — от влияния на экспрессию специфических генов до участия в построении кофакторных и специфических групп медьзависимых ферментов.

Медь как микроэлемент необходима для роста организма, нормального функционирования иммунной системы, созревания клеток крови, метаболизма глюкозы и холестерина, развития и функционирования мозговой ткани, сокращения миокарда. Дефицит меди наблюдается чаще всего у детей, может быть как наследственно обусловленным, так и приобретенным. Основные клинико-физиологические симптомы недостаточности меди: анемия, гипотония, нейтропения, повреждение фагоцитарной активности нейтрофилов, снижение сопротивляемости организма инфекциям, нарушение метаболизма глюкозы и холестерина, кардиоваскулярные поражения, аномалии костей, реже — гипопигментация волос, задержка роста. Недостаток меди изменяет острофазовый ответ нейтрофилов на вирусную инфекцию и может нарушать уровень индуцированной митогенами активности макрофагов. Было также установлено, что потребность организма в меди значительно возрастает при развитии воспалительных процессов.

Доказана необходимость меди для нормального течения эмбриогенеза. В эксперименте показано, что перинатальный дефицит меди у животных приводит не только к долговременным нейрохимическим изменениям, но и к нарушениям поведенческих реакций. Установлено, что эффекты, связанные с недостатком меди в организме обусловлены снижением активности медьзависимых металлоферментов, в том числе, аминооксидаз, аскорбатоксидаз, супероксиддисмутаз; в свою очередь, снижение активности ферментов ведет к изменению липидного обмена, активности генетического аппарата клетки, нарушению функций других тканей.

Таким образом, восполнение дефицита меди необходимо для восстановления ее баланса в организме. Существуют заболевания, связанные или обусловленные нарушением выработки ЦП и, соответственно, изменением метаболизма меди: гепатолентикулярная дегенерация (синдром Вильсона-Коновалова), синдром Менкеса, наследственная ацерулоплазминемия. При этих заболеваниях отмечается отложение избыточного количества железа и меди в некоторых тканях, что ведет к нарушению деятельности центральной нервной системы и нормального функционирования печени и поджелудочной железы. Это свидетельствует о необходимости регуляции уровня меди и важной роли церулоплазмина в этом процессе.

Медь, необходимая для поддержания метаболических процессов, в отличие от аминокислот, липидов или жирных кислот, не может быть синтезирована de novo. Количество меди, так же как и железа, марганца, цинка и селена в тканях взрослого организма, по-видимому, соответствует интенсивности метаболических процессов, в которых участвуют эти элементы. Однако концентрация их в тканях может понижаться в связи с неадекватным поступлением и адсорбцией. Предполагаемое количество несвязанных ионов меди в плазме является крайне низким, порядка 10-¹⁸ моль/л. Вероятно, ее концентрация в тканях находится на таком же уровне. Соответственно, измеряемые концентрации меди, также как и других металлов в тканях, по существу отражают количество органических лигандов, преимущественно металлозависимых ферментов, включая церулоплазмин, а также жирных кислот, аминокислот и других биологических веществ.

В начале процесса усваивания пища содержит металлоэлементы в связанной форме. В дальнейшем происходит преобразование этих соединений, однако некоторые из них не претерпевают изменений. Предотвращение поступления меди в дозах, превышающих физиологические, в норме регулируется гомеостатическими механизмами. Ионные формы меди, как и прочих металлоэлементов, обладают высоким аффинитетом к органическим лигандам и быстро образуют с ними комплексы. Абсорбированные хелаты меди поступают в циркуляцию и усваиваются всеми тканями; этот процесс сопровождается лигандным обменом с низкомолекулярными соединениями, апопротеинами и апоферментами, вплоть до формирования металлопротеинов и металлоферментов в синтезе de novo. Церулоплазмин, альбумин, транскупреин и, в какой_то степени, некоторые аминокислоты являются главными переносчиками меди в плазме. После их поступления в печень медь хранится в гепатоцитах или выводится в плазму и желчь. Избыточная медь, содержащаяся в тканях, в результате лигандного обмена высвобождается в виде хелатов до достижения нормального метаболического уровня. При острых и хронических заболеваниях высвобождение большого количества меди при ее усиленной мобилизации является интерлейкин-1-зависимым.

В настоящее время признано, что уровень пищевого поступления микроэлементов: меди, железа, цинка, марганца и, вероятно, селена зачастую оказывается меньше рекомендуемого. Соответственно, лица, имеющие ограниченный запас этих элементов, тяжелее переносят заболевания. Существует верхний предел концентрации меди, диктуемый физиологическими условиями, поскольку накопление избыточной меди нежелательно для организма. Например, в культуре in vitro было показано, что Cu²⁺ повреждает клетки и вызывает экспрессию тканевого прокоагулянтного фактора. Такие изменения в организме могут привести к развитию внутрисосудистого свертывания крови. Медь, поступившая в гепатоциты, связывается со специфическими белками, в первую очередь с металлотионеином, и включается в некоторые ферменты, в том числе в ЦП. Было показано, что включение меди в металлотионеин и в другие белки требует предварительного связывания с глютатионом, и этот процесс является АТФ-зависимым. Концентрация металлотионеина в печени изменяется в зависимости от поступления меди с пищей. Связывание меди с металлотионеином позволяет осуществить временное хранение меди в цитоплазме и защищает ткани от ее воздействия. Металлотионеин, проявляющий высокую реактивность по отношению к перекисным радикалам, играет защитную роль против медь-индуцированной цитотоксичности.

Основываясь на том, что в составе ЦП находится до 95% меди, содержащейся в плазме крови, Броман (Broman) в 1967 году впервые сформулировал и обосновал медь-транспортную функцию церулоплазмина. Дальнейшие работы подтвердили правоту Бромана. Синтезируемый печенью ЦП разносится по тканям организма и поставляет ионы меди клеткам. Установлено, что кроме печени церулоплазмин и ЦП-подобные белки могут вырабатываться и другими тканями и органами.

Клетки организма, в частности фибробласты, связывают только нативный ЦП, в свою очередь, гепатоциты избирательно связывают и поглощают только те молекулы ЦП, которые предварительно были экскретированы другими тканями организма. После связывания со специфическим рецептором на поверхности клеток и передачи этим клеткам части ионов меди ЦП подвергается интернализации с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза. Пептидная часть молекулы ЦП, прочно связанная с Cu²⁺, при трансклеточном переносе теряет остатки сиаловых кислот и освобождается в кровоток. Расположенный на плазматической мембране гепатоцитов рецептор сиаловых гликопротеинов способен распознавать десиализированный ЦП. Это позволяет гепатоцитам поглощать данную форму ЦП и выводить прочно связанную с ним медь в желчь. Кроме того, выведению ЦП в желчь способствует и то, что при удалении ионов меди из молекулы ЦП происходит высвобождение ее гидрофобных участков. Обобщив проведенные исследования, ученые НИИ экспериментальной медицины РАМН предложили схему внутриорганизменного круговорота меди и роли различных изоформ церуплазмина в переносе ионов меди.

Желчь — главный путь выведения меди из организма. Гибкая система регуляции уровня меди в плазме позволяет выводить из организма излишки меди в составе желчи уже через 30 мин после образования ее избытка. Ключевую роль в этом процессе играет церулоплазмин. Нарушения, возникающие в системе внутриорганизменного оборота меди, являются причиной патологических процессов, в основном связанных с токсическим действием меди. Наглядным свидетельством этого выступает наследственное заболевание — гепатолентикулярная дегенерация (синдром Вильсона-Коновалова). Ранее полагали, что развитие заболевания обусловлено нарушением синтеза ЦП печенью. Это подтверждал низкий уровень фермента в плазме больных. Первые попытки лечебного применения ЦП были проведены именно при этом заболевании. Однако никакого положительного эффекта не зарегистрировали. Впоследствии было установлено, что нарушен не синтез ЦП, а механизм его экскреции из тканей. Избыточное накопление ЦП и связанной с ним меди вызывало поражение печени и других тканей и органов, в которых он синтезировался. Таким образом, это явилось подтверждением важной роли ЦП в метаболизме меди — не только своевременного предоставления меди тканям, но и выведения ее излишнего количества из клеток.

Представленный в таблице 2 перечень Cu²⁺— зависимых ферментов свидетельствуем о том, что ЦП необходим также для инактивации перекисного окисления липидов в тканях, для обеспечения функционирования нервной системы, для ускорения процессов заживления ран. Все эти функции церулоплазмина нуждаются в углубленном изучении, а полученные новые данные позволят использовать лечебный препарат в новых областях медицины.

Участие ЦП в обмене железа было подтверждено результатами изучения наследственного нарушения метаболизма железа, вызванного мутацией гена церулоплазмина. Это заболевание, названное ацерулоплазминемией, характеризуется полным отсутствием ЦП в крови и сопровождается накоплением железа в тканях мозга и внутренних органов. Клинически это проявляется в дегенеративных изменениях сетчатки, неврологической и диабетической симптоматике. При исследовании роли церулоплазмина в метаболизме железа было установлено, что ЦП включается в обмен железа путем мобилизации его из железозапасающих органов, таких как печень и селезенка. Ионы железа встраиваются в апотрансферрин в трехвалентном состоянии. Этому процессу способствует ЦП, который функционирует как феррооксидаза, окисляя двухвалентное железо до трехвалентного: Fe (II) — Fe (III) > трансферрин > синтез гема > гемоглобин. Образующееся трехвалентное железо встраивается в молекулу апотрансферрина. Насыщенный железом трансферрин, в свою очередь, транспортирует железо в костный мозг, где происходит синтез гема. Исследования in vitro показали, что ЦП значительно ускоряет окисление двухвалентного железа и образование трансферрина. Таким образом, ЦП способствует кроветворению благодаря феррооксидазной активности.

Процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) протекают в организме постоянно. Важную роль в них играют активные формы кислорода. Основным субстратом перекисного окисления являются ненасыщенные и полиненасыщенные жирные кислоты фосфолипидов, эфиров холестерина и т. д. Это обусловлено наличием в этих соединениях химически неустойчивых двойных связей, легко разрывающихся при взаимодействии со свободными радикалами. Процесс окисления носит каскадный характер. Первая стадия, инициирование реакции, протекает под действием различных факторов и может осуществляться непрерывно под влиянием ионизирующей радиации, ультрафиолетового облучения, озона воздуха и некоторых химических веществ, поступающих в организм с пищей и воздухом. Образующиеся радикалы дают начало новым радикалам по механизму цепной реакции. Обрыв цепных реакций перекисного окисления липидов возможен при взаимодействии радикалов с антиоксидантами. Под антиоксидантами подразумевают широкий спектр веществ различной химической природы. Особое место среди них занимают ферментативные антиоксиданты. Основным внутриклеточным антиоксидантом является супероксиддисмутаза (СОД). В плазме крови основную антиоксидантную функцию выполняет церулоплазмин. Было показано, что антиоксидантные свойства ЦП обусловлены его электроноакцепторными свойствами. Благодаря высокой феррооксидазной активности ЦП предотвращает неферментативные реакции, дающие начало свободным радикалам и дальнейшему развитию ПОЛ.

Усиливая связывание окисленных ионов железа с трансферрином, ЦП исключает их из реакций ПОЛ. Показано, что ЦП обладает супероксиддисмутазной активностью, хотя эта активность ниже, чем у внутриклеточной супероксиддисмутазы. При генерировании супероксидных радикалов методом импульсного радиолиза было показано, что ЦП не оказывает влияния на кинетику гибели супероксидных радикалов, однако он взаимодействует c их предшественниками — гидратированными электронами. Позже установили, что ЦП взаимодействует с восстановленной формой ксантиноксидазы, а не с супероксидными радикалами. Таким образом, ЦП обладает слабой СОД-активностью и не является «ловушкой» супероксидрадикалов.

Поддержание окислительных реакций в липидах биологических мембран на постоянном уровне является необходимым аспектом нормального функционирования клеток и тканей. Показано, что при большинстве патологических состояний, особенно при онкологических заболеваниях и атеросклерозе, существенно возрастает уровень ПОЛ. Для понимания механизма патологии, обусловленной процессами ПОЛ в тканях, имеют значение два факта: 1) уровень поступления меди с пищей обычно недостаточен; 2) любой патологический процесс ведет к мобилизации меди и ее усиленному потреблению в очаге заболевания. Поскольку медь в организме не депонируется, единственным ее источником являются собственные ткани. Поэтому при многих хронических патологиях происходит снижение уровня меди в тканях. Вследствие этого нарушается синтез медь-зависимой супероксиддисмутазы и происходит усиление процессов ПОЛ в тканях. Следовательно, при использовании церулоплазмина удается восстановить уровень меди в тканях и снизить процессы ПОЛ. Это имеет важное значение при лечении онкологических больных, у которых нередко возникает полиорганная недостаточность. При клинических испытаниях препарата ЦП было показано, что он предотвращает развитие этого осложнения. Антиоксидантная активность ЦП, по-видимому, объясняет и его радиозащитный эффект. Известно, что важным механизмом патогенного действия ионизирующего облучения является образование свободных радикалов и активных форм кислорода.

Введение

экзогенного церулоплазмина при данной патологии оказывает антиокислительное воздействие, что благотворно сказывается на состоянии организма. Обладая антиоксидантными свойствами, ЦП удаляет радиотоксины, образующиеся в ранний период лучевой болезни, сохраняет систему кроветворения и оказывает действие на другие функциональные защитные системы. Таким образом, данный фермент участвует в запуске механизмов повышения радиорезистентности к ионизирующему облучению. Экспериментальные исследования показали, что введение церулоплазмина лабораторным животным до и после облучения увеличивает их выживаемость, способствует нормализации отдельных показателей гемограмм и миелограмм.

Было показано, что радиозащитным эффектом обладают и препараты меди. Поскольку ЦП — основной переносчик меди в организме, можно предположить, что транспорт меди — один из механизмов его радиозащитного действия. Лучевое поражение нарушает регуляцию кроветворения, клеточного деления, тканевого дыхания и других процессов, связанных с обменом меди и железа, что, по-видимому, является следствием поражения субклеточных структур, распадом макромолекул белков, нуклеиновых кислот и других высокомолекулярных соединений. Претерпевают повреждение металлосодержащие ферменты, в том числе внутриклеточная супероксиддисмутаза. Можно утверждать, что доставка дополнительного количества меди с помощью экзогенного ЦП позволяет восстановить нарушенную функцию медь-зависимых ферментов и способствует повышению резистентности организма к облучению. Именно поэтому, одним из современных направлений в лечении солидных опухолей является разработка препаратов, избирательно связывающих ионы меди.

Большого внимания заслуживают свойства ЦП, на основании которых он был классифицирован как белок острой фазы воспаления. Установлено, что уровень ЦП в сыворотке крови значительно изменяется при различных инфекционных заболеваниях; остром и хроническом воспалительных процессах, сопровождающихся деструктивными и некротическими изменениями в тканях; при злокачественном опухолевом росте, при наследственных ацерулоплазминемиях, при ишемической болезни сердца.

Нарастание уровня ЦП на фоне инфекционно-воспалительных осложнений соответствует представлениям об этом белке как интерлейкин-6-зависимом реактанте острофазной реакции крови. Результаты сопоставления уровня ЦП и других показателей согласуются с общепринятыми взглядами на роль процессов ПОЛ в патогенезе инфекционно-воспалительных заболеваний. Следовательно, изучение показателей ПОЛ и церулоплазмина может быть использовано для оценки эффективности оперативного лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы при контролируемом применении препаратов антиоксидантной направленности.

Несмотря на то, что ЦП является иммуномодулятором, процесс его взаимодействия с иммунной системой, особенно при супрессивном действии раковых опухолей, носит сложный характер. Установлено, что он влияет на фагоцитарную активность моноцитов, причем модуляция процесса зависит от высоты исходного уровня определяемых иммунологических параметров. Изучение влияния ЦП на митоген-индуцированную пролиферацию лимфоцитов и продукцию цитомединов мононуклеарами крови человека in vitro выявили многоэтапность его действия. На модели экспериментальной гриппозной инфекции было показано, что применение экзогенного ЦП в остром периоде инфекционного процесса увеличивает резистентность подопытных животных к вирусу гриппа, уменьшает иммунодепрессивное действие вируса и улучшает биохимические показатели. Имеются данные о противовоспалительном действии ЦП в эксперименте. Использование высоких концентраций ЦП приводило к снижению уровня ИЛ-1 В, TNFб, IFN и ИЛ-8, но не ИЛ-6, который запускает его собственный синтез в печени. Полученные результаты дают основание предполагать, что ЦП способствует формированию гуморального иммунного ответа и влияет на реакции воспаления в тканях.

Не исключено, что значительное повышение уровня ЦП в плазме крови при беременности может являться одним из объяснений феномена самопроизвольного исчезновения симптомов таких заболеваний, как ревматоидный артрит. Следовательно, противовоспалительное действие ЦП в значительной мере обусловлено его антиоксидантным действием.

Установлено, что ЦП участвует в метаболизме биогенных аминов, в особенности медиаторов нервной системы, поскольку многие ферменты, ответственные за их синтез, являются медь-зависимыми. По данным некоторых авторов, ЦП регулирует уровень норадреналина, адреналина, серотонина, 6-гидроксидофамина. В присутствии кислорода 6-гидроксидофамин подвергается окислению с образованием хинонов и активных форм кислорода. ЦП окисляет это вещество, предотвращая образование токсичных продуктов, повреждающих ткань мозга. Поскольку ЦП синтезируется клетками головного мозга, то вполне вероятно, что он, контролируя время распада медиаторов, способен влиять на функционирование элементов нервной системы.