Лабораторная диагностика. 
Возбудители свиного гриппа

1) Вирусологический метод диагностики.

Материалом для исследования смывы из носоглотки, выделения из носа, которые принимают сухими или влажными стерильными ватными тампонами в первые дни заболевания, мокроты. Вирусы можно обнаружить в крови, спинномозговой жидкости. При летальных случаях забирают кусочки пораженных тканей верхних и нижних дыхательных путей, головного мозга и т. п. Носоглоточные смывы берут натощак. Больной должен трижды прополоскать горло стерильным физиологическим раствором хлорида натрия (10−15 мл), который собирают в стерильную банку с широким горлом. После этого кусочком стерильной ваты протирают заднюю стенку глотки, носовые ходы, затем ее окунают в банку со смывом. Можно взять материал стерильным, увлажненным в растворе хлорида натрия тампоном, которым тщательно протирают заднюю стенку глотки. После забора материала тампон погружают в пробирку с физиологическим раствором, к которому добавлено 5% инактивированной сыворотки животных. В лаборатории тампоны полощут в жидкости, отжимают у стенки пробирки и удаляют. Слив выдерживают в холодильнике для отстаивания, затем отбирают среднюю часть жидкости в стерильные пробирки.

К материалу добавляют антибиотики пенициллин (200−1000 ЕД / мл), стрептомицин (200−500 мкг / мл), нистатин (100−1000 ЕД / мл) для уничтожения сопутствующей микрофлоры, выдерживают 30 мин при комнатной температуре и используют для выделения вирусов, предварительно проверив его на стерильность. Чувствительным методом выделения вирусов заражения 10−11-дневных куриных эмбрионов. Материал в объеме 0,1−0,2 мл вводят в амниотическую или аллантоиса полости. Заражают, как правило, 3−5 эмбрионов. Эмбрионы инкубируют при оптимальной температуре 33−34 ° С в течение 72 часов. С целью увеличения количества вирионов в исследуемом материале его предварительно концентрируют. Для этого используют методы адсорбции вирусов на куриных эритроцитах, обработку 0,2% раствором трипсина с целью усиления инфекционных свойств вирусов или осаждают их по специальным методикам.

После инкубации куриные эмбрионы охлаждают при температуре 4 ° С в течение 2−4 ч, затем отсасывают стерильными пипетками или шприцем алантоисну или амниотическую жидкость. В этой с помощью РГА определяют наличие инфекционного вируса. Для этого смешивают равные объемы (0,2 мл) вирусмисткого материала и 1% взвеси эритроцитов кур. О положительной реакции (наличие вируса в материале) свидетельствует оседания эритроцитов в виде зонтика. При наличии в материале вируса, который имеет гемаглютинуючи свойства, его титруют с помощью развернутой РГА, определяя титр гемаглютинуючои активности. С помощью этой реакции определяют титр гемаглютинуючого вируса — наибольшее разведение материала, которое еще дает реакцию гемагглютинации. Это количество вируса принимают за одну гемаглютинуючу единицу (ГАО).

2) РТГА.

Для этого сначала готовят рабочее разведение вирусного материала, которое содержит 4 ГАО вируса в определенном объеме. Учет реакции проводят после образования осадка эритроцитов в контрольных лунках. О положительной реакции свидетельствует задержка гемагглютинации в исследуемых лунках. Выделять вирусы гриппа можно, используя различные линии культур клеток — эмбриона человека, почек обезьян, перевиваемой линии клеток почек собаки (MDCK) и другие.

В клеточных культурах проявляется цитопатическое действие вирусов (появление клеток с фестончатыми краями, вакуолями, формирование внутриядерных и цитоплазматических включений), которая завершается дегенерацией монослоя клеток. Для идентификации выделенных вирусов используют РТГА (при условии, если тите гемагглютинина составляет в культу рал ьний жидкости не менее 1:8). Кроме этой реакции можно использовать РГГадс, однако она менее чувствительна и требует титра иммунной сыворотки не менее 1:160 а также РСК, РН, РЕМА подобное.

• 3) Иммуноферментный анализ.
• (ИФА) получил широкое распространение в диагностике различных инфекционных заболеваний в связи с высокой чувствительностью и специфичностью анализа, высокой проивзодительностью, простотой проведения анализа и регистрации результатов, возможностью использования микроколичества диагностического материала и автоматизации процесса. ИФА используют для определения как антител, так и антигенов в биологических жидкостях.

Иммуноферментный анализ позволяет обнаружить рибонуклеопротеиновый родоспецифический антиген вируса гриппа в носоглоточных секретах больных острой респираторной инфекцией. Разработаны отдельные тест-системы ИФА для диагностики гриппа, А и В, то есть клинический материал исследуется с помощью двух тест-систем одновременно. ИФА в данном случае может применяться для этиологической диагностики случая респираторной инфекции или для скрининга клинических материалов перед вирусовыделением. Однако этот метод не позволяет выявить штаммовую специфичность возбудителя гриппа.

Материалом для исследования служат выделения из носовой полости больных респираторной вирусной инфекцией, получаемые путем аспирации секретов с помощью аспирационных емкостей, соединенных с вакуумным насосом. Отобранные секреты разводят в 5 раз фосфатно-солевым буферным (ФСБ) раствором с 0,05% твина-20. Для ИФА-диагностики гриппа допускается использование и носоглоточных мазков. При этом ватные тампоны со слизью и клетками ресуспендируют в 2 мл ФСБ с 0,05% твина-20, а перед исследованием двукратно замораживают-размораживают для выделения вирусных антигенов из клеток. Подготовленные клинические материалы можно сохранять на протяжении 3−4 мес. при температуре — 15−20°С.

ИФА базируется на выявлении антигенов вирусов гриппа, А и В с помощью моноклинальных (МК) антител к рибонуклеопротеину (РНП) соответствующих возбудителей в сендвич-варианте: противогриппозные МК антитела адсорбируют в лунках планшета, после чего к ним последовательно добавляют контрольный и исследовательский материалы, а после соответствующей экспозиции — конъюгант специфических МК антител с пероксидазой хрена. Образованный иммунный комплекс: МК — антитела к РНП вирусов гриппа А/В — РПН-антигены вирусов гриппа А/В — меченные пероксидазой МК-антитела к РНП вирусов гриппа А/В выявляют добавлением субстратной смеси, в состав которой входят перекись водорода (субстрат пероксидазы) и ортофенилендиамин (краситель). После определенной экспозиции (до появления желтой окраски в лунках с положительными контрольными образцами) ферментную реакцию останавливают серной кислотой. При проведении каждого этапа ИФА лунки планшета перед добавлением следующего компонента промывают буферным раствором.

Результаты рассчитывают с помощью автоматизированных спектрофотометров (ридеров) при длине волны 490 нм, определяя показатели оптической плотности смеси в лунках планшета. При этом учитывают коэффициенты, указанные в инструкции к тест-системе, позволяющие рассчитать оптическую плотность, выше которой исследовательские образцы считаются положительными.

4) ПЦР Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод геномолекулярного исследования клинических и секционных материалов, который может применяться для экспресс-диагностики гриппа. Однако чаще ПЦР-метод используется для широкого спектра экологических исследований на грипп. В основе метода — выявление в исследовательских образцах генетических последовательностей определенных вирусов гриппа и их амплификация к сотням миллионов копий, идентифицируемых методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) или гибридизационно-иммуноферментным анализом. В нашей стране ПЦР пока что не нашла широкого применения в практической инфектологии.

Иммунохроматографический анализ (ИХА), или быстрые тесты. Материалом для исследования являются носоглоточные смывы, которые наносят на нитроцеллюлозный фильтр с определенными иммунными ингредиентами, заправленный в пластиковую кассету. Результат исследования учитывают через 5−15 мин. При наличии антигенов вируса гриппа проявляются две красные полосы, одна из которых контрольная.

5) Серологическая диагностика.

Серологическая диагностика гриппа базируется на выявлении возрастания титра противогриппозных антител в динамике заболевания или на определении специфических иммуноглобулинов класса М.

Для данного вида диагностики гриппа чаще применяют РТГА. Последнюю выполняют микрометодом с использованием микропланшетов для иммунологических исследований (общий объем реакции -100 мкл).

В процессе серологического исследования сывороток крови в РТГА используют их последовательные (начиная с 1:10) двукратные разведения на изотоническом растворе натрия хлорида, диагностикумы вирусов гриппа А (Н1N1), A (H3N2) и В в рабочем разведении 4 ГАЕ в 25 мкл, а также взвесь эритроцитов петуха или человека с группой крови 0 в концентрации 0,4−0,5% (соотношение объемов перечисленных компонентов РТГА 1:1:2).

Перед исследованием сыворотки крови обрабатывают с целью освобождения их от неспецифических ингибиторов гемагглютинации вирусов гриппа. Для этого чаще используют универсальный препарат — рецепторразрушающий энзим (РРЭ), подходящий для устранения неспецифической ингибиции гемагглютинации вирусов гриппа всех типов. РРЗ представляет собой фермент нейраминидазу, получаемую из нехолерных вибрионов.

Термолабильные мукополисахаридные ингибиторы разрушают прогреванием сывороток при температуре 56 °C на протяжении 30 мин. Для освобождения от термостабильных ингибиторов можно использовать риванол (этакридина лактат), двуокись углерода и т. п. Однако эти методы по эффетивности значительно уступают методу обработки РРЭ, поскольку могут частично разрушать и антитела.

Для серодиагностики гриппа можно исследовать и одну только сыворотку крови больного на наличие противогриппозных иммуноглобулинов класса М, которые свидетельствуют об острой инфекции. При отдельном определении антител класса М сыворотку крови больного предварительно разделяют на 2 порции, одну из которых сохраняют до постановки определенной серологической реакции, а другую обрабатывают для разрушения макроглобулинов класса М физическими или химическими методами. Один из них — прогревание порции сыворотки при 60 °C на протяжении 30 мин, второй — обработка порции сыворотки 2-меркаптоэтанолом. После этого обе порции исследуют, например, в РТГА. Снижение титров противогриппозного антигемагглютинина в 4 и более раз в порции сыворотки, в которой предварительно разрушали иммуноглобулин, свидетельствует об их наличии в исследуемой сыворотке, что лабораторно подтверждает диагноз гриппа.

Существует методика выборочного удаления из одной порции исследуемой сыворотки противогриппозных lg с помощью белка, А золотистого стафилококка (штамма Cowan). При последующем серологическом исследовании обеих порций сыворотки выявление сниженного или неизмененного титра специфических антител в обработанной порции свидетельствует о наличии в ней иммуноглобулина, Отсутствие антител в обработанной порции сыворотки (при их наличии в необработанной) позволяет сделать вывод, что выявленные антитела принадлежат к классу иммуноглобулинов, а респираторное заболевание вызвано не вирусом гриппа.

6) МФА Метод флюоресцирующих антител (МФА, прямой метод Кунса) является довольно надежным методом быстрой диагностики гриппа, позволяющим обнаружить антигены вируса гриппа непосредственно в клиническом материале через 2−3 ч от момента его взятия. МФА исследуют клетки цилиндрического эпителия слизистой оболочки в участке нижней носовой раковины и задней стенки глотки, которые отбирают сухими ватными тампонами и помещают в среду для транспортировки вирусов. В лаборатории тампоны встряхивают, отжимают и удаляют, а взвесь центрифугируют на протяжении 20 мин со скоростью 3 тыс. об./мин. Из осадка клеток готовят мазки на обезжиренном предметном стекле.

Для выявления антигенов вируса гриппа в пробах секционного материала делают отпечатки кусочков ткани легкого, а также готовят препараты со слизистой оболочки трахеи и бронхов, соскребая клетки эпителия или плотно прижимая участок пораженной слизистой оболочки к стеклу. Из каждого образца исследуемого на грипп материала делают по 3 мазка на стекле.

На подсушенные и зафиксированные (например, холодным ацетоном) препараты исследуемых клеток наносят специфические гипериммунные люминесцентные сыворотки к вирусам гриппа А (Н1N1), A (H3N2) и В. После 30-минутной инкубации предметные стекла тщательно промывают буфером, подсушивают и осуществляют микроскопическое изучение клеток с помощью люминесцентного микроскопа.

Локализация и характер свечения антигена вируса зависят от стадии развития возбудителя в клетке, а также от срока возникновения гриппозной инфекции. В первые 3 дня заболевания антиген чаще локализуется в ядрах клеток цилиндрического эпителия при одновременном диффузном или гранулярном свечении цитоплазмы в той же или в разных клетках. Часто определяется равномерное гомогенное свечение всей клетки с плохой дифференциацией ее внутренней структуры.

При затухании инфекционного процесса свечение преимущественно наблюдается в цитоплазме или в отдельной ее части в виде гранул.

При сопоставлении количества пораженных клеток, находящихся в поле зрения люминесцентного микроскопа, и срока течения гриппа отмечено их повышение (6−10) в первые 3 дня заболевания.

Диагностически значимым является специфическое свечение пяти и более клеток цилиндрического эпителия с яркостью не менее чем 2+.

7) Выделение вируса гриппа на куриных эмбрионах Этот метод диагностики гриппа является наиболее доступным и чувствительным. Используют 9−11-дневные куриные эмбрионы, которые заражают инфекционным материалом в объеме 0,1 мл в амниотическую и аллантоисную полости, после чего эмбрионы инкубируют при температуре 33−34°С 72 ч.

При выделении вируса гриппа С материал инокулируют только в амниотическую полость 7 дневных куриных эмбрионов и инкубируют при температуре 33 °C 5 сут.

После соответствующей инкубации эмбрионы охлаждают на протяжении 16−18 ч при 4 °C и осуществляют их вскрытие. Далее отбирают эмбриональные жидкости — амниотическую и аллантоисную, в которых проводят индикацию вируса гриппа. Для этого используют реакцию гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами морской свинки, петуха или человека с группой крови 0. Доказано, что эритроциты млекопитающих более чувствительны, чем куриные, для индикации вируса в эмбриональных жидкостях на ранних пассажах. Когда вирус уже адаптирован к куриным эмбрионам для индикации целесообразно использовать эритроциты петуха, которые больше по размерам и быстрее оседают.

Если результат РГА отрицательный, проводят два-три дополнительных слепых пассажа, после чего (при сохранении результата РГА) исследование материала прекращают, а образец считают несодержащим вирус гриппа.

В случае наличия агглютинации эритроцитов собранную эмбриональную жидкость освещают центрифугированием в течение 10 мин при скорости 10 тыс. об./мин и хранят при 4 °C. При необходимости дополнительного культивирования выделенного вируса эмбриональную жидкость разводят раствором Хенкса или забуференным физиологическим раствором до концентрации 10−100/ГАЕ мл и используют для последующего заражения куриных эмбрионов.

При положительной РГА проводят титрование изолята в этой же реакции. Для этого изолят последовательно разводят с кратностью 2 в двух параллельных рядах лунок планшета для иммунологических исследований от 1:2 до 1:1280 в объеме 0,2 мл. При каждом разведении в каждую лунку добавляют по 0,2 мл физиологического раствора натрия хлорида и по 0,4 мл 1% взвеси эритроцитов петуха. Через 20−30 мин учитывают результат титрования вируса в РГА. Различие титра в двух рядах может не превышать одно-двукратного разведения. Если разница больше, титрование следует повторить. Вычисляя титр (в случае двукратного различия), высчитывают его среднеарифметическое значение.

Если титр в РГА 1:8 или больше, вирус идентифицируют в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Если он меньше чем 1:8, его стараются повысить.

Существует несколько методов повышения гемагглютинирующей активности свежевыделенных штаммов вируса гриппа. Чаще всего это — проведение дополнительных пассажей на куриных эмбрионах методом пограничных разведений. Успешно используют и ультразвук, разрушающий ингибиторы, блокирующие гемагглютинины вируса. После 5−7-минутной обработки ультразвуком гемагглютинирующая активность вируса возрастает в 4−16 раз, что ускоряет возможность идентификации выделенных вирусов в РТГА.

После определения достаточного гемагглютинирующего титра изолированного вируса гриппа, его идентифицируют в РТГА. Для этого готовят рабочее разведение вируса, который содержит 4 ГАЕ в заданном объеме жидкости (если титровали в объеме 0,2 мл, то в 0,2 мл). Контролируют правильность приготовления рабочего разведения и, если необходимо, корригируют его. После такой коррекции необходимо снова проверить правильность рабочей дозы возбудителя. Далее осуществляют постановку РТГА: к последовательным разведениям коммерческих диагностических сывороток против возбудителей гриппа, А (Н1N1), A (H2N2), A (H3N2), В и С до определенного в инструкции титра добавляют равный объем рабочего разведения выделенного вируса в каждую лунку каждой сыворотки. После определенной экспозиции (чаще 1 ч при комнатной температуре) в каждую лунку вносят двойной объем эритроцитов петуха и через 30 мин определяют результат.

В случае использования для идентификации вируса гриппа в РТГА диагностических иммунных сывороток, относительно которых не указано, что они получены к ингибиторрезистентным штаммам вируса гриппа, их освобождают от неспецифичных ингибиторов гемагглютинации вируса или для контроля берут неиммунную сыворотку крови от животного одного и того же вида, при иммунизации которого получена диагностическая сыворотка. Если такая контрольная сыворотка тормозит гемагглютинацию вируса в титре 1:20—1:40, то идентификацию вируса следует проводить только после устранения ингибиторов.

В тех случаях, когда для идентификации вирусов гриппа используются диагностические сыворотки, полученные к ингибиторрезистентным штаммам, дополнительная обработка их не нужна.

Таксономическая характеристика выделенного вируса гриппа определяется в РТГА по той диагностической сыворотке, которая тормозит его гемагглютинацию. После идентификации вируса вирусологическое исследование считается законченным.

Если выделенный вирус значительно отличается в титрах РТГА от эталонного штамма (к которому получена диагностическая сыворотка, и титр которого указан на этикетке) или идентификация его в РТГА оказывается неудачной, тип вируса можно определить в реакции связывания комплемента (РСК).

В РСК используют гемолитическую сыворотку в трехкратном титре, две дозы предварительно оттитрованного комплемента и аллантоисный антиген в количестве 12−16 ГАЕ (по РГА). Разводить антиген ФБР (рН 7,0−7,2) выше, чем 1:10 не рекомендуется.

Использование в РСК иммунных сывороток морской свинки и аллантоисного антигена не нуждается в титровании комплемента в их присутствии, поскольку они не обладают антикомплементарными свойствами.