Этиология и патогенез вирусного гепатита С

Этиология. Содержание вируса гепатита C в крови низкое, поэтому его очень трудно обнаружить с помощью микроскопии. Культивирование вируса in vitro разработано плохо, поэтому его изучают в экспериментах на шимпанзе.

При исследовании вирусной РНК было выделено по меньшей мере 6 генотипов вируса, внутри которых существуют подтипы. Среди вирусов, принадлежащих к одному подтипу, в том числе выделенных у одного больного, тоже наблюдается изменчивость, приводящая к образованию псевдовидов. Высокая изменчивость вируса препятствует формированию гуморального иммунитета. Нейтрализующие антитела сохраняются недолго и не могут предотвратить повторное заражение не только другим, но даже тем же самым штаммом вируса, то есть не возникает даже типоспецифический иммунитет. Одни генотипы вируса встречаются повсеместно, другие — только в определенных районах. Генотипы различаются по патогенности и чувствительности к противовирусным препаратам [5, 11].

Первые методики ИФА для выявления вируса были основаны на определении антител к рекомбинантному антигену С100−3, аналогу белка NS4. Обычно эти антитела появляются через 1−3 мес. после начала острого гепатита С, но иногда их не обнаруживают в течение года и более. В тестах второго поколения используют рекомбинантные белки С22−3 (аналог белка капсида), СЗЗс (аналог белка NS3) и С200, объединяющий СЗЗс и С100−3. Их чувствительность на 20% выше, чем у тестов первого поколения, и антитела выявляются на 30−90 дней раньше, во время острого гепатита. В тестах третьего поколения используют рекомбинантные и синтетические аналоги белка NS5, антитела к которому можно выявить еще раньше.

Рис. 4. Схема прямого твердофазного ИФА

Поскольку при использовании вышеописанных тестов отмечались ложноположительные и ложноотрицательные реакции, для подтверждения диагноза применяют иммуноблоттинг (сыворотку инкубируют с нитроцеллюлозной мембраной, на которую нанесены рекомбинантные или синтетические вирусные антигены, разделенные с помощью электрофореза).

Метод позволяет определить антитела к отдельным белкам вируса и выявить ложноположительные результаты ИФА. Последнее особенно важно при низкой априорной вероятности гепатита С (например, у доноров) или наличии антител, могущих дать ложноположительную реакцию (например, ревматоидного фактора).

Однако с помощью серодиагностики невозможно выявить всех инфицированных вирусом гепатита С. Для этого лучше пользоваться определением вирусной РНК с помощью ПЦР.

Анализ РНК HCV (определение РНК вируса гепатита С), часто называемый анализ ПЦР гепатита С — это исследование крови, позволяющее выявить непосредственно генетический материал вируса гепатита (каждый вирус — это одна частица РНК). Этот тест чаще всего выполняется методом ПЦР, — отсюда и название ПЦР гепатита С. Существуют качественный и количественный анализы на РНК ВГС.

Качественный анализ указывает на наличие вируса в крови. Данный тест необходимо проводить всем пациентам, у кого обнаружены антитела к гепатиту С. Его результат может быть «обнаружено» или «не обнаружено». Референсные значения (значение, которое должно быть в норме) — «не обнаружено». Результат «обнаружено» может свидетельствовать о том, что вирус размножается и инфицирует все новые клетки печени. Качественный тест ПЦР имеет определенную чувствительность (10−500 МЕ/мл.). Это означает то, если вирус присутствует в крови в очень малой концентрации (ниже порога чувствительности метода), может быть получен результат «не обнаружено». Поэтому, при проведении качественного ПЦР у пациентов с низкой виремией (концентрацией вируса), например, проходящих противовирусную терапию, важно знать чувствительность диагностической системы. Для контроля вирусологического ответа при проведении противовирусной терапии желательно использовать диагностическую систему с чувствительностью не ниже 50 МЕ/мл. Таким критериям соответствуют, например, анализаторы COBAS AMPLICOR ВГС-TEST (аналитическая чувствительность 50 МЕ/мл или 100 копий/мл), РеалБест РНК ВГС (аналитическая чувствительность 15 МЕ/мл или 38 копий/мл) и другие.

ПЦР анализ, стоимость которого зависит от применяемых реактивов, и может составлять от 300 руб. до 5000 руб., выполняется от одних суток до недели.

Кроме метода ПЦР для выявления РНК ВГС также используется метод транскрипционной амплификации (ТМА), обладающий лучшей чувствительностью (порядка 5−10 МЕ/мл.), однако этот метод в России пока не распространен.

Как часто нужно делать ПЦР гепатита C? Обычно его проводят сразу после обнаружения антител к гепатиту C и после 4-й, 12-й, 24-й недели противовирусной терапии, а также через 24 недели после завершения ПВТ, а затем — ежегодно, в случае УВО [12].

Рис. 5. Пример результатов качественного ПЦР гепатита С

Количественный анализ ПЦР (вирусная нагрузка) — это тест на концентрацию вируса (виремию) в крови. Вирусная нагрузка — это количество единиц генетического материала (вирусной РНК), которая присутствует в определенном объеме крови (обычно это 1 мл, что соответствует 1 кубическому сантиметру). Это количество выражается в цифрах, единицы измерения МЕ/мл (международные единицы на миллилитр). Количество вируса может быть отображено по-разному. Например, 1,5 млн. МЕ/мл, что соответствует 1.500.000 МЕ/мл или 1.5* 10⁶ МЕ/мл. В некоторых лабораториях используются другие единицы измерения — копии/мл. Коэффициент пересчета из копий в международные единицы различный для разных тест-систем. Примерно значения можно пересчитать по формуле 1 МЕ/мл = 4 копии/мл, например, 5.5* 10⁵ МЕ/мл = 2.2* 10⁶ копий/мл.

Важно знать, что не существует прямой связи между концентрацией вируса в крови и тяжестью гепатита С.

Вывод: чем выше концентрация вируса, тем выше риск передать вирус, например, при половых контактах или вертикальным путем. Во-вторых, концентрация вируса влияет на эффективность лечения (если лечение будет проводиться на основе интерферона). Так, низкая вирусная нагрузка является благоприятным фактором при проведении терапии, а очень высокая — неблагоприятным. Также, количественный ПЦР имеет большое значение при проведении интерфероновой терапии для оценки ее успешности и планировании длительности курса. Так, при быстром ответе на лечение и низкой виремии перед терапией, сроки лечения могут быть сокращены. И, наоборот, при медленном снижении концентрации вируса, ПВТ может быть продлена [12].

Патогенез. После инфицирования HCV гематогенно попадает в гепатоциты, где преимущественно и происходит его репликация. Поражение клеток печени обусловлено прямым цитопатическим действием компонентов вируса или вирусспецифических продуктов на клеточные мембраны и структуры гепатоцита и иммунологически опосредованным (в том числе аутоиммунным) повреждением, направленным на внутриклеточные антигены HCV. Течение и исход инфекции HCV (элиминация вируса или его персистенция), определяет, прежде всего эффективность иммунного ответа макроорганизма. При острой фазе инфекции уровень РНК HCV достигает высоких концентраций в сыворотке крови в течение первой недели после инфицирования. При остром гепатите С (как у людей, так и в эксперименте) специфический клеточный иммунный ответ запаздывает как минимум на один месяц, гуморальный — на два месяца, вирус «опережает» адаптивный иммунный ответ. Развитие желтухи (следствие Т-клеточного повреждения печени) редко наблюдают при остром гепатите С. Примерно через 8−12 нед после инфицирования, когда возникает максимальное увеличение уровня АЛТ в крови, происходит снижение титра РНК HCV. Антитела к HCV определяются несколько позже и могут вообще отсутствовать, а их появление не означает окончания инфекции. У большинства больных развивается хронический гепатит С с относительно стабильной вирусной нагрузкой, которая на 2−3 порядка ниже, чем в острой фазе инфекции. Только небольшая часть больных (около 20%) выздоравливает. РНК HCV перестает определяться при использовании стандартных диагностических тестов. Исчезновение вируса из печени и. возможно, из других органов происходит позднее, чем из крови, поскольку возврат вирусемии обнаруживают у некоторых пациентов и подопытных шимпанзе даже через 4−5 мес. после того, как РНК HCV перестала определяться в крови. До сих пор неизвестно, исчезает ли вирус из организма окончательно. Почти у всех спонтанно выздоровевших от острого гепатита С пациентов можно наблюдать сильный поликлональный специфичный ответ Т-клеток, что убедительно доказывает зависимость между длительностью и силой специфического клеточного иммунного ответа и благоприятным исходом болезни. Напротив, клеточный иммунный ответ у пациентов с хронической НСV-инфекцией обычно слабый, узкофокусный и/или непродолжительный. Факторы вируса и хозяина, обусловливающие неспособность иммунного ответа контролировать HCV-инфекцию. изучены недостаточно. Известен феномен ускользания из-под контроля иммунного ответа хозяина, который обусловлен высокой мутационной изменчивостью генома HCV. результатом чего является способность вируса к длительной (возможно, пожизненной) персистенции в организме человека [6, 14].

При HCV-инфекции возможно появление разнообразных внепечёночных поражений, обусловленных иммунопатологическими реакциями иммунокомпетентных клеток, которые реализуются либо иммуноклеточными (гранулёматоз, лимфомакрофагальные инфильтраты), либо иммунокомплексными реакциями (васкулиты различной локализации).

Морфологические изменения в печени при вирусном гепатите С неспецифичны. Наблюдают преимущественно лимфоидную инфильтрацию портальных трактов с образованием лимфоидных фолликулов, лимфоидную инфильтрацию долек, ступенчатые некрозы, стеатоз, повреждение мелких жёлчных протоков, фиброз печени, которые встречают в различной комбинации и которые определяют степень гистологической активности и стадию гепатита. Воспалительная инфильтрация при хронической HCV-инфекции имеет свои особенности: в портальных трактах и вокруг очагов повреждения и гибели гепатоцитов преобладают лимфоциты, что отражает участие иммунной системы в патогенезе поражения печени. В гепатоцитах наблюдают жировую дистрофию, при этом стеатоз печени в большей степени выражен при инфицировании генотипом За, по сравнению с генотипом 1. В настоящее время помимо морфологического описания полученных биоптатов разработано несколько систем числовой оценки, которые позволяют проводить полуколичественное (ранговое) определение ИГА — активности воспалительно-некротического процесса в печени, а также стадии болезни, определяемой по степени выраженности фиброза (индекса фиброза). На основании этих показателей определяют прогноз заболевания, стратегию и тактику противовирусной терапии.