Влияние веществ изопреноидного пути биосинтеза (стеринов и цитокининов) на устойчивость растений к патогенам рода Phytophthora и солям тяжелых металлов

Проблема получения устойчивых к различного рода патогенам растений по-прежнему остро стоит перед исследователями, несмотря на успехи, достигнутые в последние годы. В частности, патогены рода Phytophthora (например, Р. infestans) ежегодно наносят ощутимый ущерб сельскому хозяйству. Помимо традиционных приемов селекции для отбора устойчивых к тому или иному патогену растений, перспективным является использование биотехнологических методов. Как правило, в отношении поражаемых Р. infestans растений (картофеля, томатов) селекционные методы работы направлены на интродукцию в культурные растения генов устойчивости к заболеванию (R-генов) от диких форм растений. R-гены являются необходимыми для развития т.н. вертикальной устойчивости, которая, однако, сравнительно быстро преодолевается патогеном за 1−2 сезона. Более надежной представляется получение форм растений с горизонтальным типом устойчивости, однако, генетические механизмы данного типа устойчивости до сих пор неизвестны. Показано, что на устойчивость растений к патогенам (а также, абиотическим факторам среды) влияет физиологический статус растения, например, гормональный баланс, содержание вторичных метаболитов, фитостеринов и т. д. Так, в ряде модельных систем (авокадо Persea americana — патоген Colletotrichum gloeosporoidesрастения табака Nicotiana tabaccum — гусеницы Manduca sexta) показано, что повышенный уровень одного из растительный гормонов — цитокининов, повышает устойчивость растений к различного рода стрессам (абиотическим и биотическим — заражению грибами, вирусами, вредителям), но длявзаимодействия с патогенами рода Phytophthora это явление не изучено. Изучение влияния цитокинина in vivo возможно, повышая его уровень добавлением экзогенно, на мутантах со сверхпродукцией цитокининов, в том числе, растениях, экспрессирующих ген синтеза цитокининов ipt.

А&оЪаМепит Ште/аЫет. Также, известен факт зависимости роста и размножения патогенов родов РкуШрЫкога и РуШит от экзогенных стеринов, однако, степень их зависимости и корреляция между уровнем устойчивости растений и содержанием стеринов — открытый вопрос. В нашей лаборатории с помощью методов клеточной селекции на устойчивость к полиеновым антибиотикам, были получены растения картофеля и томатов, с повышенным уровнем сопротивляемости к фитофторозу. Однако, взаимосвязь этих событий (устойчивость к полиеновому антибиотику — измененный состав стериновустойчивость к патогену) не была подтверждена в ряду поколений в связи со сложностью генетического анализа на упомянутых объектах. Решить эту проблему возможно с использованием хорошо изученного модельного растения АгаЫЛорягз ЛаИапа, для которого описан патоген из рода Рку^рЫкога — Р. Ъгаьзгсае. Таким образом, целью нашей работы являлось изучение влияния измененного состава цитокининов у растений картофеля с бактериальным геном синтеза цитокининов на устойчивость к заражению вирулентой расой Рку^рЫкога т/е81ат и солям никеля и меди, а также, измененного состава стеринов А. ЖаНапа на устойчивость к Р. Ъгаззжае. Соответственно, задачами работы являлось:

1) получение трансгенных растений картофеля с бактериальным геном биосинтеза цитокининов ipt и анализ его экспрессии;

2) анализ полученных растений на устойчивость к заражению Р. ш/еу^ту;

3) подбор условий для анализа устойчивости растений картофеля к абиотическому стрессу — солям меди и никеля, и оценка устойчивости полученных трансгенных растений;

4) получение растений арабидопсиса, устойчивых к полиеновому антибиотику нистатину, и проверка стабильности признака в морфогенетическом цикле «каллус-растение-каллус», а также, в. ряду половых поколений при самоопылении;

5) оценка устойчивости полученных растений арабидопсиса и Т-ДНК инсерционных мутантов арабидопсиса по генам биосинтеза стеринов из коллекции Arabidopsis Stock Research Institute к патогену P. brassicae.

Выводы.

1. На основе сорта Адретта создана коллекция трансгенных растений с бактериальными генами ipt и nptll, контролирующими синтез изопентилтрансферазы и неомицинтрансферазы, соответственно. Трансгенность растений доказана методом ПЦР.

2. Среди трансгенных растений проведен опосредованный анализ экспрессии гена ipt методами in vitro с использованием экзогенных цитокининов и ауксинов. Выявлены трансгенные растения, у которых экспланты характеризовались измененной чувствительностью к обоим гормонам или одному из них. Полученные результаты свидетельствуют, что у трансгенных растений с геном ipt изменен уровень гомрона/ов.

3. Среди природной популяции P. infestans проведен отбор наиболее вирулентного изолята, содержащего 4 гена вирулентности, который был использован для заражения растений картофеля методом изолированных листьев. Тест с патогеном P. infestans не выявил различий по степени поражения между трансгенными и контрольными растениями.

4. Подобраны условия (концентрация соли, тип экспланта) для оценки устойчивости эксплантов растений картофеля сорта Адретта к солям тяжелых металлов — никеля и меди. Среди трансгенных растений выявлены формы, которые характеризуются повышенной, по сравнению с контролем, устойчивостью к обеим солям одновременно, или одной из них.

5. С использованием модельной системы — трансгенные растения картофеля с геном ipt, показано, что повышение эндогенного уровня цитокинина в растении увеличивает уровень устойчивости последних к абиотическим стрессам (солям тяжелых металлов), но не влияет на устойчивость к патогену P. infestans.

6. Методом опосредованной клеточной селекции проведен отбор клеточных линий арабидопсиса, устойчивых к нистатину. Показано, что устойчивость к нистатину у клеточных линий теряется частично при формировании растений-регенерантов и полностью — при самоопылении в поколениях — 114. Низкая вероятность получения нистатин-устойчивых мутантов и неспецифичность действия нистатина как селективного агента указывет на нецелесообразность его использования в экспериментах по клеточной селекции на устойчивость арабидопсиса к Р. ЬгаББкае.

7. Использование Т-ДНК инсерционного мутанта ИИ^Г!, характеризующегося измененным биосинтезом стеринов, показано, что уменьшение ситостерина и кампестерина в тканях не повышает устойчивость растений арабидопсиса к Р. ЬгазБжае.

Заключение

.

Проблема зависимости развития реакций устойчивости к различным стрессам от физиологического состояния растения, например, уровня гормонов, не решена окончательно. Несмотря на имеющиеся свидетельства о повышенной устойчивости к различным факторам растений с увеличенным содержанием цитокининов, до сих пор не проводился анализ этой зависимости для растений — хозяев какого-либо из видов Phytophthora. Нами был проведен анализ на модельной системе «трансгенные растения картофеля, содержащие бактериальный ген синтеза цитокининов — ipt, — патоген Р. infestans». Кроме того, была изучена устойчивость трансгенных растений к абиотическим факторам — солям металлов (сульфату меди и хлориду никеля). Отсутствие различий в симптомах заражения у трансгенных растений картофеля с геном синтеза цитокининов ipt по сравнению с исходным сортом, неустойчивым к фитофторозу, не подтверждает значимую роль цитокининов в развитии устойчивости, по крайней мере, в случае описанной модельной системы. Наличие устойчивости у эксплантов трансгенных растений картофеля к солям металлов (одной из них, или обеим), а также измененная чувствительность большей части форм к экзогенным гормонам, позволяют говорить о позитивном влиянии цитокининов на устойчивость к различным стрессам у растений картофеля.

По поводу степени зависимости патогенов рода Phytophthora от стеринов (в частности, от стеринов хозяйских растений) в литературе также ведутся споры. Несмотря на имеющиеся данные о влиянии стеринов (и особенно, ситостерина) на рост мицелия и процессы полового и бесполого размножения у этих патогенов в условиях in vitro, изучение этой зависимости, проведенное у растений арабидопсиса — мутанта по гену биосинтеза стеринов DWF1, не позволяет подтвердить эту корреляцию in vivo. В нашей лаборатории ранее были получены растения картофеля и томатов, устойчивые к полиеновым антибиотикам (филипину и нистатину). Часть из полученных растений демонстрировали повышенную устойчивость к поражению фитофторозом. Рабочая гипотеза: устойчивые к антибиотику растения приобрели устойчивость за счет изменения в составе стеринов, что, в свою очередь, привело к формированию устойчивости к фитостерин-зависимой Р. infestans. Однако не было показано, что устойчивость к антибиотику и устойчивость к патогену наследуются совместно.

Нами была проведена работа по получению растений арабидопсиса, устойчивых к полиеновому антибиотику нистатину. Из отобранных на селективной среде каллусных линий были получены растения, для которых анализ признака устойчивости показал его сохранение у 27 растений из 50 при прохождении морфогенетического цикла «каллус — растение — каллус». Эти данные свидетельствуют о том, что у части растений изменения, приводящие к антибитикоустойчивости, связаны с генетическими, а не эпигенетическими изменениями. Однако анализ наследования признака в потомстве от самоопыления этих растений показал потерю признака в ряду поколений. По-видимому, поскольку нистатин является неспецифическим агентом, на уровне каллусных тканей происходил отбор линий с эпигенетическими изменениями. Кроме того, среди отобранных растений не было выявлено форм с повышенной устойчивостью к поражению патогеном Р. Ъга$ 81сае. Полученные данные позволяют рассматривать нистатин как неспецифический агент, устойчивость к которому может быть связана с эпигенетическими изменениями в растительных клетках, в дальнейшей практике, по-видимому, его использование нецелесообразно.

Анализ Т-ДНК инсерционных мутантов с помощью ПЦР и по фенотипу позволил выявить гомозиготные формы по гену синтеза стеринов 1: растения представляют собой карлики с редуцированными листьями и сильно сниженной фертильностью. Тест с заражением патогеном карликовых растений <1м?/1/сЫ>/1 не выявил отличий в степени поражения этих растений по сравнению с контролем. По-видимому, устойчивость к фитофторозу может быть связана не с качественным отсутствием какого-либо класса стеринов, а с измененным соотношением стеринов в растении. Полученные данные позволяют предложить дальнейший план работ, связанный с анализом фитофтороустойчивости не у точковых мутантов по генам синтеза стеринов, а у растений с измененным соотношением стеринов, полученных в результате трансформации конструкциями, содержащими гены синтеза стеринов. Положительным моментом является также то, что подобные растения, описанные в литературе, во многих случаях имеют нормальный фенотип, в отличие от точковых мутантов.

Таким образом, нами не подтверждена роль цитокининов в развитии устойчивости у растений картофеля к биотическому (Р. infestans) стрессупоказана корреляция между измененным уровнем цитокининов и повышенной устойчивостью к тяжелым металлам (медь, никель) — не удалось получить формы арабидопсиса, устойчивые к нистатину, что связано с неспецифическим характером этого антибиотикадальнейшая работа будет посвящена поиску устойчивых к фитофторозу форм среди трансгенных растений с измененным соотношением стеринов.