Иммунобиологические свойства вакцинного штамма КС вируса классической чумы свиней

Классическая чума свиней (КЧС) является наиболее опасной вирусной болезнью домашних и диких свиней, причиняющей серьезный экономический ущерб многим странам с развитым свиноводством.

КЧС высококонтагиозная мультисистемная геморррагическая вирусная болезнь свиней, которая может иметь острую, подострую, хроническую (длительно текущую) форму, а также может протекать латентно. Летальность колеблется в широких пределах (до 100%).

По классификации МЭБ КЧС относится к группе, А болезней животных. Она регистрируется в Европе, Центральной и Южной Америке и Азии, отсутствует в Австралии, Новой Зеландии, Северной Америке и Африканском континенте. В настоящее время многие страны (кроме ЕС) с целью контроля или ликвидации КЧС используют традиционные живые вакцины.

Характерной особенностью эпизоотии КЧС в Европе в конце прошлого века является легкая и хроническая форма заболевания с нарушениями функции воспроизводства (Harkness, 1985; Куриннов и др., 1992; Вишняков и др., 1998; Коломыцев, и др., 1998, 2000). Причиной такого течения болезни является широкая циркуляция низковирулентных штаммов вируса, вызывающих слабоманифестированную хроническую инфекцию (Baker, Sheff, 1960; Liss, 1984, Donaldson, 1987). Наличие латентных форм, возможность длительного вирусоносительства, сходство с другими болезнями, затруднительная клиническая и лабораторная диагностика осложняют своевременное выявление КЧС и способствуют ее распространению. Этому также в значительной степени способствуют оживленные экономические связи между хозяйствами, регионами и странами.

Быстрая и точная диагностика КЧС — один из решающих факторов эффективной борьбы с болезнью и снижения экономических потерь. Диагноз на КЧС ставится на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических и лабораторных методов исследования. Совершенствование диагностики КЧС остается актуальной задачей современной ветеринарной вирусологии.

Лабораторная диагностика КЧС основывается на выявлении вирусного антигена, специфических антител, обнаружении вирусного генома и выделении вируса. Она может осложняться наличием ложноположительных реакций из-за антигенного родства с другими пестивирусами, латентно инфицирующими свиней (Wensvoort et al., 1986, 1989). Выделение вируса в культуре клеток PK-15 — наиболее чувствительный и традиционный метод диагностики КЧС, поскольку он позволяет выявить присутствие небольшого количества вирулентного вируса (Mengeling, 1970; Вишняков и др., 1986). Дифференциация вакцинированных и инфицированных свиней при этом методе облегчается тем, что вакцинный вирус не выявляется через 2 недели после иммунизации (Carbrey, 1988). Наличие вируса в культуре клеток выявляют и идентифицируют с использованием меченых антисывороток и моноклональных антител (МФА, PLA) (Edwards et al., 1991; Van Oirschot, Terpstra, 1989). Кроме PLA, для обнаружения вируса КЧС в культуре клеток японские исследователи предложили метод «экзальтации» вируса болезни Ньюкасла (Kumagi et al., 1961) и метод обратной интерференции вируса везикулярного стоматита (Thuchiya et al., 1993). Однако эти методы не получили практического применения.

Для обнаружения вирусного антигена в патологическом материале используют МФА. Исследуют мазки-отпечатки миндалин и других органов павших и убитых животных, а также криосрезы тканей (Stair et al., 1963,.

Mengeling, Pirtle, 1963, Кулеско, 1972, Carbrey et al., 1970, Попов 1984, Вишняков, 1984). Этот метод оказался быстрым и надежным для выявления вирусного антигена и используется во многих странах. С его помощью была ликвидирована КЧС в США.

Другим современным методом, применяемым для обнаружения вируса КЧС, является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). С помощью этой реакции вирус КЧС может быть обнаружен в инфицированных культурах клеток и в материалах от больных и павших животных (Liu et al., 1991, Harding et al., 1994; Непоклонов 1998, 1999). Кроме того, этим методом удалось различать вакцинные штаммы (13 штаммов) от полевых Европейских изолятов (23 изолята) с помощью рестриктазного анализа ГЩР-продуктов. ДНК-амплификаты 5'-некодирующей области генома вируса КЧС расщепляли эндонуклеазой (Vilceketa., 1998).

Серологические методы диагностики КЧС играют важную роль, однако, их значение различно и зависит от стратегии борьбы с этим заболеванием. В странах Западной Европы и других странах в отсутствии вакцинации обнаружение вирусспецифических антител служит основанием для постановки диагноза на КЧС.

В России и ряде других стран, где проводится широкомасштабная вакцинация свиней против КЧС, определение уровня специфических антител может иметь значение при оценке иммунного статуса животных и проведении соответствующих мероприятий по специфической профилактике (Малярец и др., 1995; Вишняков и др., 1985).

Значительный прогресс при разработке высокоспецифичных тест-систем для обнаружения антител к вирусу КЧС был достигнут при применении технологии рекомбинантных белков (Rumenapf et al., 1991; van Ziji, Wensvoort, de Kluyver, 1991; Hulst et al., 1993; Nepoklonov et al., 1997).

Специфическая профилактика с давних пор занимала важное место в борьбе с КЧС, особенно в странах с высокоразвитым свиноводством. С разработкой живых вакцин против КЧС открылась новая эра в специфической профилактике этой болезни. Исследования начатые полвека тому назад в США (Koprowski et al., 1946, Baker, 1960) завершились в итоге на Тайване созданием первого безопасного лапинизированного штамма С (CL) вируса КЧС и одноименной вакцины (Lin, Lee, 1981). Вакцина из штамма С после тщательной проверки (Bognar, Meszazos, 1963, Лихачев, Агеева, 1964, Florent et al., 1969) на безопасность и иммуногенность получила всеобщее признание и широкое применение в разных странах, неблагополучных по КЧС, в том числе в странах Западной Европы. Например, только в Голландии в 1982;1986 гг. для профилактики КЧС использовали 38 млн. доз лапинизированной вакцины С (Terpstra С. et.al. 1990). Эту вакцину наиболее широко применяли в различных странах Европы, Азии и Южной Америки. Исследования по дальнейшему совершенствованию средств специфической профилактики КЧС были продолжены в ряде стран. В результате были предложены новые технологические решения, в частности, размножение вакцинного штамма С в культуре клеток вместо организма кролика и разработаны новые культуральные вакцины на основе других безопасных высоко иммунногенных аттенуированных штаммов вируса КЧС. Кроме престижа, эти разработки имели коммерческую направленность, а именно на снижение затрат при изготовление вакцины путем повышения урожая вируса. Например, в 1 мл культуральной вакцины содержалось в 10−100 раз больше вакцинного вируса, чем в лапинизированной вакцине.

Таким образом, в результате серии работ с 60-х годов прошлого века специфическая профилактика КЧС стала осуществляться с помощью живых вакцин на основе аттенуированных штаммов вируса, размноженных в организме кроликов или в культуре клеток. Имея небольшие различия между собой, все они характеризуются общностью иммунобиологических свойств, в том числе, полной безопасностью и высокой иммуногенностью.

Кроме создания живых вакцин, во многих высокоразвитых странах проведены обширные исследования по изучению эффективности их применения в зависимости от различных условий. С самого начала с применением живых вакцин против КЧС связывали надежды сокращения экономических потерь и возможность ликвидации болезни в масштабах целых стран. Стратегия борьбы с КЧС в разных странах была и остается различной. Одни страны полностью исключают вакцинацию, другие прибегают к ней в случае крайней необходимости, как к вынужденной и временной мере, третьи — используют ее как основную меру борьбы и профилактики КЧС. Меры борьбы с КЧС часто определяются эпизоотологической ситуацией и социально-экономическими факторами. Положительный опыт борьбы с КЧС с помощью вакцинации накоплен во многих странах, в том числе в РФ.

1.2. Современные живые вакцины против КЧС.

Вирус КЧС является типичным представителем рода Pestivirus, в который кроме него входит еще 6 антигенных групп: 2 группы вируса диареи КРС (BVDV-1 и BVDV-2), 3 группы вируса пограничной болезни овец (BDV-1, BDV-2, BDV-3) и одну антигенную группу представляет штамм HI38, выделенный от жирафа в Кении 30 лет тому назад (Becher Р., et al., 2003). Пестивирусы представляют собой частицы диаметром 40−60 нм округлой формы, покрытые рыхлой оболочкой, в состав которой входят 3 белка El, Е2 и Ems, ответственные за антигенные и иммуногенные свойства. Иммунодоминантным белком вируса КЧС считается гликопротеин Е2 (Van Oirschot, 1999).

Вирус КЧС способен размножаться в клеточных культурах различных видов млекопитающих (Pirtle and Kniazeff, 1968, Roche and Edwards, 1994). Однако наиболее чувствительными и продуктивными в отношении вируса КЧС являются культуры клеток, полученные из тканей свиней.

Одной из отличительных особенностей вируса КЧС является его способность размножаться in vitro, как правило, без цитопатического эффекта (Van Oirschot, 1999, Moenning, 1990). В некоторых ранних работах имелись единичные сообщения о размножении некоторых штаммов вируса КЧС с вяловыраженным ЦПЭ (Gillespie et al., 1960, Van Beckum, Barterling, 1970, De Castro, 1973, Laude, 1978). Отчетливо выраженный ЦПЭ отмечен при размножении слабовирулентного штамма ALD вируса КЧС в культуре клеток стромы костного мозга новорожденных поросят (Shimizu et al., 1995). Следует отметить, что данный штамм вируса размножается в традиционных клеточных культурах без ЦПЭ. За цитопатогенность трех изолятов вируса КЧС ответственными оказались дефектные интерферирующие частицы (ДИЧ-частицы), присутствующие в вирусной популяции наряду с полногеномными вирусными частицами (Meyers, Thiel, 1995). 2 новых цитопатогенных изолята вируса КЧС (cpMVPl и cpBWl) выделены от естественно инфицированных свиней. Оба они содержали дефектные (делеционные) частицы (Kosmidou et al., 1998).

Получены 2 линии клеток почки свиньи (FS-L3 и CPK-NS) в которых вакцинный штамм GPE" вызывает ЦПЭ. Эти линии клеток пригодны для выявления ВНА к вирусу КЧС на основе подавления цитопатогеннного действия вируса GPE" (Sakoda et al., 1998).

Оказалось возможным титровать вирус GPE" в культуре клеток на основе интерференции с обычными цитопатогенными вирусами по «отрицательным бляшкам» (Fukusho et al., 1976).

Стабильную линию клеток почки поросят CPK-NS выращивали в среде без сыворотки. Штаммы вируса КЧС, не вызывающие экзальтацию вируса Ньюкаслской болезни, размножались в клетках CPK-NS с выраженным ЦПЭ. Титр вируса по ЦПЭ коррелировал с титром в PLA (Sakoda et al., 1998).

Все современные культуральные вакцинные штаммы, используемые для промышленного изготовления традиционных живых вакцин, размножаются в клеточных культурах без ЦПЭ.

Важная роль в контроле КЧС принадлежит специфической профилактике. Создание эффективных вакцин против КЧС всегда вызывало особый интерес. Так как инактивированные вакцины оказались малоэффективными (Koenen et al., 1988), особое внимание было уделено разработке живых вакцин. Новая эра в специфической профилактике КЧС связана с получением трех аттенуированных вакцинных штаммов: китайского лапинизированного штамма С (синонимы LC, LPC) и двух культуральных штаммов — японского (GPE") и французского (Тиверваль).

Многолетние исследования этих штаммов, проведенные в разных странах в лабораторных и полевых условиях не выявили принципиальных различий между ними. Все они характеризуются безопасностью для свиней различного возраста и физиологического состояния и выраженной иммуногенностью, которая отчетливо проявляется устойчивостью вакцинированных свиней к экспериментальному заражению вирулентным штаммом вируса КЧС (Van Oirschot, 2003).

С целью усовершенствования технологии изготовления живой вакцины из китайского штамма С его адаптировали к размножению в различных культурах клеток. В результате на основе китайского штамма С в разных странах создана серия культуральных вакцин, получивших фирменные названия: ВГНКИ (Россия) — Suvac (Венгрия) — Cellpest (Польша) — Pestiffa (Merial, Франция) — TVM (Чехия) — Egermann (Riems, Германия) — NordenMinnesota AnchorColvasan Sanocon Porcivac (Мексика) (Vilcek and Belak, 1998).

Несмотря на различие способов аттенуации трех наиболее известных основных вакцинных штаммов (С, GPE* и Тиверваль) и различные модификации размножения в клеточных культурах, при анализе их основных свойств просматривается прототипность с лапинизированным китайским штаммом С. Примером может служить опыт применения различных живых вакцин в Мексике, где с начала 90-х годов использовали вакцины: PAV-1, Minnesota, GPE, PAV-20 и С. Когда иммуногенность указанных вакцин сравнили стандартным методом контрольного заражения различия в эффективности не обнаружили. Однако во всех случаях эффективность вакцинации свиней в хозяйствах оказалась менее выраженной, чем в лабораторных условиях. Из 44 выборочного зараженных свиней только 28 (64%) имели полную 100% защиту без каких-либо клинических признаков инфицирования (Morilla-Gonzalez, 2002).

Другие примеры сравнительного изучения различных вакцинных штаммов вируса КЧС так же свидетельствуют об их тождестве или идентичности по основным свойствам. Однако существует мнение, что одни вакцинные штаммы способны преодолевать материнский иммунитет более эффективно, чем другие (Ogawa et al., 1973).

В настоящее время для профилактики КЧС применяют живые вакцины из нереактогенных безопасных вирусных штаммов, аттенуированных длительным пассированием в организме кроликов или в культуре клеток. К наиболее хорошо изученным и широко применяемым относятся, прежде всего, лапинизированный китайский штамм (С, LC или LPC), а также культуральные штаммы, японский (GPE*), французский (Tiverval). Для изготовления живой вакцины против КЧС в странах Европы, Азии и Южной Америки, в основном, применяли китайский лапинизированный штамм С в оригинальном виде или его культуральные варианты. В странах бывшего СССР с 1968 г. применяли в основном культуральную вакцину из штамма ЛККС (Сергеев, Непоклонов, Алипер, 2001).

Штамм С получен на Тайване из лапинизированного штамма Ровак ч (Koprowski et al., 1946) путем дальнейшего пассирования в организме кроликов более чем 800 внутривенных пассажей) (Лин и Ли, 1981). В результате был получен безопасный, ареактогенный и высокоиммуногенный вакцинный штамм С (Van Oirschot, 1999).

По-видимому, существуют различные варианты китайского штамма, аттенуированные длительным серийным пассированием на кроликах, которые используют в производстве вакцины (Van Oirschot, 2003). Изучение генетической основы аттенуации показало, что в З'-некодирующей области генома С-штамма имеется непрерывная вставка из 13 богатых урацилом нуклеотидов, чего нет в вирулентном (Moormann 1996, Wong et al, 2001) или родительском штаммах (Wu et al, 2001). Однако до конца не ясна ее роль в аттенуации штамма С (Van Oirschot, 2003).

Свойства штамма С впервые были описаны Богнаром и Месарошем (1963). По их данным вакцина из этого штамма вызывала иммунитет к экспериментальному заражению у 95−100% свиней через 4−5 дней после однократной вакцинации, который длился не менее 2−3 лет. Вакцинация не только защищала от болезни, но и подавляла репродукцию вирулентного штамма вируса КЧС после экспериментального заражения (Biron et al., 1987) и, кроме того, предотвращала передачу его от привитых свиней неиммунным свиньям, находящимся в контакте (Terpstra, Wensvoort, 1987). Хотя отдельные случаи горизонтальной передачи штамма С от привитых к не привитым свиньям имели место (Bognar, Meszaros, 1963, Biron et al., 1987, Terpstra, Tielen, 1976), он сохранял свойства аттенуации даже после 20−30 экспериментальных серийных пассажей на восприимчивых свиньях (Van Oirschot, 1999). Более того, штамм оставался безопасным для иммуносупрессированных свиней (Florent, Thomas, Leunen, 1969, Kamijyo et al., 1976). Фенотипически аттенуация С штамма вируса КЧС проявляется в ограничении его размножения в организме свиней, главным образом, в лимфоидных тканях и, в первую очередь, в клетках миндалин (Terpstra, 1978), которые являются основными входными воротами инфекции в естественных условиях. Следует отметить, что вирусный антиген у вакцинированных свиней изредка обнаруживали в других органах (Terpstra,.

1978). Штамм С может преодолевать плацентарный барьер супоросных свиней, однако при этом не вызывает каких-либо нарушений развития инфицированных плодов (Tesmer et al., 1973) и не причиняет вреда свиноматкам и новорожденным поросятам (Dingeldein et al., 1976; Marks, 1977; Van Oirschot, 2003).

Безопасность и высокая эпизоотологическая эффективность вакцинного штамма С была подтверждена в результате широкого применения в ряде стран (Bekaert, Leunen, 1969, Terpstra, Robijns, 1977, Van Oirschot, 2003). Производство оригинальной живой вакцины из штамма С основывается обычно на использовании крови, селезенки, лимфоузлов зараженных кроликов. Сухая кроличья вакцина по содержанию вакцинного вируса в 10−100 и более раз уступает культуральным вакцинам.

Стремясь усовершенствовать технологию массового производства и стандартизацию вакцины, многие исследователи пошли по пути изыскания чувствительных культуральных клеточных систем для размножения штамма С. Таким образом, в разработке и производстве живых вакцин против КЧС наметилось 3 независимых пути: 1) оригинальная вакцина из штамма С, размноженного в организме кроликов- 2) модифицированные вакцины из штамма С, адаптированного и размноженного в различных культурах клеток- 3) оригинальные вакцины, полученные из других штаммов: Тиверваль (Aynaud et al., 1976) и GFE (Shimizu, 1980), с самого начала аттенуированных и размноженных в различных культурах клеток при пониженной температуре. Все указанные вакцинные штаммы соответствовали требованиям OIE (2000).

Первые практически наиболее значимые исследования по получению и размножению вакцинных штаммов вируса КЧС в клеточных культурах с целью изготовления вакцины проведены в СССР и были завершены в 1967 году. С тех пор было налажено серийное промышленное изготовление двух живых вакцин с использованием для массового размножения двух клеточных систем: 1) культуры клеток тестикулярной ткани ягнят — вакцина JIK.

ВНИИВВиМ (Сергеев и др. 1971, 1980) и вакцина КС (Сергеев, Непоклонов, Алипер, 2001) — 2) первичной культуры клеток почки эмбрионов свиньивакцина ВГНКИ (Мищенко, 1972, Лихачев, Мищенко, 1974).

Вакцинный штамм JTK получен длительным пассированием вируса КЧС в первичной культуре и субкультуре клеток тестикулярной ткани ягнят (ТЯ). Эти культуры также использовали для массового выращивания вируса при изготовлении сухой вакцины. Многочисленные лабораторные и полевые испытания показали, что ЛК-вакцина по безопасности и иммуногенности подобна вакцине из штамма С. Фенотипически штамм ЛК отличался от штамма С отсутствием способности вызывать гипертермическую реакцию у кроликов при внутривенном введении. На основе филогенетического анализа и в соответствии с Европейской Классификацией (Lowings, Ibata, Paton, 1996) штамм С отнесен к подгруппе 1.1. (референтный штамм Alfort), а штамм ЛК-КС к подгруппе 1.2. (референтный штамм Breshia) (Гребенникова и др., 1999).

За последние 30 лет на Покровском заводе биопрепаратов, в основном для свиноводческих хозяйств СССР и России, были изготовлены сотни серий вакцины в количестве более миллиарда доз. С 1997 года аналогичную вакцину (КС) готовит НПО НАРВАК. Вакцина КС из клонированного штамма Ж отличается от вакцины ЛК лишь более высоким накоплением вакцинного штамма (107−107'5 ТЦЦбо/мл) в роллерной культуре клеток ТЯ.

Вакцина ВГНКИ из штамма С, адаптированного и размноженного в первичной культуре клеток почки эмбрионов свиньи уступала вакцине ЛК по содержанию вируса в 10 и более раз. Кроме того, этот метод размножения вакцинного вируса не исключал возможности эндогенной контаминации вакцины латентными вирусами свиней, в том числе, полевым вирулентным штаммом вируса КЧС. Следует отметить, что размножение вакцинных штаммов вируса КЧС в культурах клеток «свиного происхождения» противоречит требованиям OIE (2000 г.).

Много лет спустя, в Германии штамм С так же выращивали в первичной культуре клеток почки эмбрионов свиньи (Dahle, Liess, 1995). Свиньи, привитые такой вакциной внутримышечно в дозе >100 ИмДго за 1, 2, 3 и 4 недели до интраназального заражения вирулентным штаммом вируса КЧС (1000 ТКИД5о) приобрели выраженный иммунитет. На 3−7 дни после заражения вирус в крови не обнаружен. Титр ВНА возрастал и достигал максимума >1:2000 к 4 неделям после вакцинации. Он практически не увеличивался, если заражение проводили через 4 недели после вакцинации. При заражении в более ранние сроки отмечали выраженный бустерный эффект. У невакцинированных животных и погибших после заражения вирус постоянно обнаруживали в крови и органах.

Лапинизированный штамм С был адаптирован к первичной культуре клеток почки ягнят (Goret et al., 1971). Этот штамм накапливался в титре не более 105 ИмДбо/мл и оказался безопасным для супоросных свиноматок, новорожденных поросят и откормочных свиней. Иммунитет наступал в течение недели после вакцинации и сохранялся более года. Вакцинированные свиноматки передавали антитела потомству с молозивом. Лиофилизированная вакцина сохраняла активность в течение года при 4 °C. (Precaustra, 1975, 1983).

Лапинизированный китайский штамм сохранял исходные свойства после адаптации и размножения в культуре тестикулярных клеток телят (Zheng-Zi Cai et al., 1997). Аналогичные результаты получены при размножении штамма С в культуре клеток почек ягнят (Barnaure et al., 1977). В указанной культуре вирус накапливался в тире 5×104/мл (ИД50 для кроликов). Из этого вируса было приготовлено 76 серий лиофилизированной вакцины, которой привито более 8 млн. свиней. Такая вакцина обладала выраженной иммуногенностью и сохраняла активность в течение года при -10°-15°С или в течение 9,5 месяцев при4°С.

Минимальная прививная доза вакцины равная 100 ИМД50, в основном считалась достаточной для контроля циркуляции вируса в хозяйстве (В iron et al., 1987), хотя в ряде случаев ее повышали в 5 и более раз (Vandeputte et al., 2001, Zheng-Zi Cai et al., 1997).). Вакцина Pestiffa производится фирмой Мериал с использованием линии клеток почки ягнят (IR04 kindly) (Vandeputte, Chappuis 1999, Ghenut et al, 1999).

Исходя из ведущей роли гуморального иммунитета при КЧС, изучали корреляцию между титром вакцинальных антител (NPLA) и иммунитетом (штамм С, вакцина Pestiffa). Определяли размножение, экскрецию и горизонтальную передачу вирулентного вируса, а также защиту от заболевания и гибели свиней при интраназальном заражении (100 ИД50). Свиньи с титром ВНА 1:12,5-<1:50 проявляли все атрибуты инфицирования, кроме гибели. При титре 1:50−1:300 вирус размножался (бустерный эффект), но не экскретировался и не распространялся горизонтально, что представляет особый интерес с эпизоотологической точки зрения (Terpstra, Wenswoort, 1988). ч Штамм С, адаптированный к первичной культуре клеток почки кролика, получил название штамма CPA (C-Porto-Alegre), а вакцина из этого штамма PAV-250. Вакцинный штамм CPA сохранил свойства родительского штамма и оставался активным при 4 °C 12 месяцев (Vidor, Martins, 1991, Correa et al., 1992). В институте Ф. Лефлера (о. Риме, Германия) в качестве эффективного субстрата для промышленного размножения использовали культуру клеток эмбриона кролика (Glaner, Tesmer, 1985, Kaden, Lange, 2001).

Вакцина из штамма С, адаптированного к культуре клеток почки свиньи линия SK-6 (Kasza et al., 1972) получила название Cidepest. 1 ТКИД50 вакцины соответствовала 1 дозе, защищающей 50% вакцинированных свиней (1SwPD50). В практических условиях рекомендовано вакцину применять в дозе 400−600 ТКИД50 Прочный иммунитет у привитых 6−8-недельных серонегативных поросят наступал на 7 день и длился более 6 месяцев (срок наблюдения). Титр ВНА у таких поросят через 6, 12 и 26 недель после вакцинации был в пределах 1:16−1:256. Все вакцинированные свиньи после заражения вирулентным вирусом были защищены от заболевания и гибели, однако через 2 недели после заражения титр ВНА увеличился в несколько раз (1:200−1:1000), что свидетельствовало об ограниченном размножении вирулентного вируса в вакцинированном организме, клинически полностью устойчивом к экспериментальному заражению. В дальнейшем линия клеток БК-6 была адаптирована к росту в суспензии (Тегрэ^а, е1 а1., 1990).

В культуре клеток РК-15 штамм С накапливался в более высоком титре, чем в первичных культурах клеток почек и тестикул поросят. В роллерной культуре и в суспензионной культуре на микроносителе Цитодекс-3 через 96 ч вирус накапливался в титре 8,0 ^ ТКИД50/мл. Вакцина СеПреБ!, приготовленная из этого вируса, по безопасности и иммуногенности была аналогична вакцине из исходного лапинизированного штамма С (Сау е1а1., 1989).

Штамм С был адаптирован к культуре клеток почки минисвиньи (линия МРК), чего не удалось сделать при использовании линии клеток почки кролика ЯК-13. Указанный успех позволил провести целую серию исследований с вакцинным штаммом вируса КЧС, размноженным в культуре клеток МРК. При адаптации вируса использовали суспензию клеток о селезенки кролика (10 кл/мл), инфицированного штаммом С, и клетки МРК (5×106кл/мл). Размножение вируса контролировали на кроликах и выявляли в селезенке инфицированных кроликов методом флюоресцирующих антител. После 20−25 пассажей в культуре клеток МРК вирус максимально накапливался в титре 8,0 ^ ТКИД5(/мл и вызывал температурную реакцию у кроликов в разведении 1:7240. Двухмесячные поросята, привитые этим вирусом (1:20−1:1280) оказались иммунными в течение 11 месяцев (срок наблюдения). Через 30 дней после вакцинации титр ВНА у поросят был в пределах 1:32−1:256, а через 30 дней после контрольного заражения титр ВНА повысился до 1:1024−1:4096. Заражение вакцинированных поросят не сопровождалось выделением вируса с секретами и экскретами. У всех вакцинированных животных, убитых через 8 дней после заражения, в крови и тканях вирус не обнаружен (4 пассажа в МРК), в отличие от контрольных свиней (Rivero et al., 1988, 1990, Gualandi et al., 1991).

Через 30 дней после вакцинации свиней в полевых условиях титр ВН-антител был в пределах 1:32−1:128 (Rivero et al., 1988, Ferrari, 1992). Результаты этих опытов показали, что живые культуральные вакцины на основе С-штамма по безопасности и иммуногенности были подобны оригинальной лапинизированной вакцине и отличались от нее более совершенной технологией и большей производительностью (Ferrari, 1992, Terzic et al., 1998).

Японский GPE" вакцинный штамм получен пассированием слабовирулентного полевого штамма ALD в различных клеточных культурах при 30 °C. Он прошел 142 пассажа в культуре клеток тестикулярной ткани свиней и клонирован методом предельных разведений- 36 пассажей в культуре клеток тестикулярной ткани КРС, вновь клонирован тем же методом, а затем прошел 41 пассаж в культуре клеток почки морской свинки и получил название штамм GPE". Вакцинный штамм GPE" в отличие от исходного вирулентного хорошо размножался в культуре клеток морской свинки (G-маркер) при 30 °C и плохо при 40 °C (Т-маркер). Испытание этого штамма на поросятах подтвердило его безопасность и высокую иммуногенную активность. У привитых поросят ВНА образовывались в титре 1:32−1:256 (Sasahara, 1980). Геном штамма GPE" отличался от генома родительского штамма по 225 нуклеотидам (Ishikawa et al, 1995). Вакцина на основе штамма GPE' получила название GPE-вакцина. Систематическое применение этой вакцины и других мер контроля позволило ликвидировать КЧС в Японии (Edwards et al., 2000).

Штамм Тиверваль получен из вирулентного штамма Альфор после более чем 170 серийных пассажей в культуре клеток при 29−3 0 °C и мог быть идентифицирован несколькими маркерами in vitro (Launais et al, 1972; Aynaud, 1988). По безопасности и иммуногенности он был подобен другим вакцинным штаммам.

Вакцинный вирус присутствует в организме привитых свиней не более 10−15 дней (СгеЬепшкоуа е1 а1., 1996., Ьогепа е1 а1., 2001). Вакцинные штаммы можно различать от полевых изолятов вируса КЧС с помощью рестриктазного анализа ПЦР-продукта. ДНК-амплификаты 5л-некодирующей области генома вируса КЧС расщепляли эндонуклеазой^{аЬегегИпу} е1 а1., 1999). Однако такая возможность не решала одну из важных задач серодиагностики. Главный недостаток приведенных выше живых вакцин, состоит в том, что индуцируемые ими антитела не отличаются от антител, которые образуются после инфицирования вирусом КЧС, что делает невозможным различить инфицированных животных от вакцинированных. Эта проблема решалась путем создания маркированных вакцин.

4. ВЫВОДЫ.

1. Определены условия массового размножения вакцинного штамма КС в субкультуре клеток тестикулярной ткани ягнят (ТЯ), обеспечивающие получение вируса с титром 6,5−7,5 ПСИД^о/мл.

2. Клетки первичной культуры ТЯ могут длительно храниться в жидком азоте (>2 лет) без потери способности к субкультивированию и репродукции штамма КС.

3. Выращивание клеток ТЯ в среде с сывороткой, содержащей нейтрализующие антитела к вирусу диареи КРС в титре 1:16, не влияет на накопление штамма КС в роллерной культуре клеток ТЯ.

4. Установлена корреляция биологической активности сухой вакцины КС при титровании в культуре клеток РК-15 (ТКИД5о) и на свиньях (ИмД50). Иммуногенная активность вакцины для свиней практически равна инфекционной активности в культуре клеток (ИмД5о=ТКИД5о).

5. По длительности виремии, антигенным и иммуногенным свойствам для свиней штамм КС не отличался от двух широко известных вакцинных штаммов СЬ и ЛК вируса КЧС. Однако, в отличие от лапинизированного штамма СЬ он не обладал реактогенностью для кроликов.

6. Определены режим изготовления и методы контроля сухой вакцины КС, обеспечивающие гарантированную активность при хранении и эффективность применения в практических условиях.

7. Рекомбинантный химерный вирус КЧС-ВД сохранил антигенные и иммуногенные свойства исходного вакцинного штамма КС и приобрел способность вызывать ЦПД в культуре клеток ТЯ и РК-15. Титр вируса по ЦПД составлял 0,1% по сравнению с титром вируса в РЬА.

8. В результате оптимизации условий размножения, хранения и лиофилизации вируса активность сухой вакцины КС повышена в 10 раз по сравнению с базовым вариантом — вакциной ЛК.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

На основании проведенных исследований разработаны и предложены для практического применения: вакцина КС против классической чумы свиней живая культуральная сухая. Извещение № 1 об изменении ТУ 9384−018−80−64−98, утверждено Генеральным директором «НПО НАРВАК» 20 марта 2003 г. и согласовано с Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ 20 марта 2003 г. наставление по применению вакцины КС против классической чумы свиней живой культуральной сухой. Утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ 20 марта 2003 г.