Взаимодействие Citrobacter freundii метионин — ?-лиазы с субстратами и ингибиторами в растворе и кристалле

ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Пиридоксаль-5'- фосфат зависимые ферменты, участвующие в метаболизме серосодержащих аминокислот, как мишени для рационального дизайна новых лекарственных средств
1. Химические основы многообразия реакций, катализируемых ПЛФ-зависимыми ферментами
- 1. 2. Механизм реакций, катализируемых ПЛФ-зависимыми лиазами
- 1. 3. Механизмы ингибирования ПЛФ-зависимыми ферментов
  - 1. 3. 1. Нековалентная инактивация
  - 1. 3. 2. Активированные нуклеофилы
  - 1. 3. 3. Активированные электрофилы
  - 1. 3. 4. Проблема специфичности потенциальных ингибиторов
2. ПЛФ-зависимые ферменты, участвующие в метаболизме серосодержащих аминокислот
- 2. 1. Сравнительный анализ хода полипептидной цепи в молекулах ПЛФ-зависимых ферментов, участвующих в метаболизме метионина и цистеина
3. Ферменты метаболизма серосодержащих аминокислот — новая мишень для лекарственных средств
- 3. 1. Цистатионин-у-синтаза
- 3. 2. Цистатионин-р-лиаза
- 3. 3. Цистатионин-у-лиаза
- 3. 4. Цистализин
- 3. 5. Цистатионин-р-синтаза
- 3. 6. О-Ацетил серии—сульфогидро л аза
- 3. 7. Метионин-у-лиаза
  - 3. 7. 1. Структурные различия между бактериальной МГЛ и человеческой ЦГЛ
  - 3. 7. 2. МГЛ как потенциальная мишень для антимикробных агентов
II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
- 2. 1. Введение
- 2. 2. Кинетические параметры взаимодействия МГЛ с субстратами и ингибиторами
- 2. 3. Кинетика обмена а- и Р-протонов конкурентных ингибиторов МГЛ
- 2. 4. Установление химии ПЛФ в двух пространственных структурах МГЛ
- 2. 5. Спектральные характеристики комплексов фермента с аминокислотами в растворе и кристалле
- 2. 6. Взаимодействие МГЛ с Ь-циклосерином
ВЫВОДЫ
III. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
- 3. 1. Выращивание бактериальной массы, выделение и очистка фермента
- 3. 2. Определение концентрации белка
- 3. 3. Определение активности фермента
- 3. 4. Определение чистоты выделенного фермента
- 3. 5. Получение 2-[2Н]-аминокислот
- 3. 6. Кинетические исследования
- 3. 7. Спектральные исследования фермента
- 3. 8. Кристаллизация МГЛ
- 3. 9. Микроспектрофотометрические исследования кристаллов МГЛ

Взаимодействие Citrobacter freundii метионин — ?-лиазы с субстратами и ингибиторами в растворе и кристалле (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Пиридоксаль-5'-фосфат является одной из активных форм витамина Вб, который способствует нормальному функционированию мозга, образованию клеток крови, поддерживает химический баланс в организме, принимает участие в метаболизме углеводов, белков и липидов. В середине сороковых годов впервые было показано, что ПЛФ является кофактором ферментов, участвующих в метаболизме аминокислот [1]. С этого времени ПЛФ-зависимые ферменты становятся предметом активного изучения. Этот интерес объясняется уникальной способностью ферментов данного класса катализировать широкий спектр реакций в метаболизме аминокислот. На сегодняшний день известно более чем 140 различных ферментов, имеющих в качестве кофактора ПЛФ. ПЛФ-зависимые ферменты не только участвуют в синтезе, взаимных превращениях и деградации аминокислот и биогенных аминов, они также играют большую роль в синтезе тетрапиррольных соединений и метаболизме аминосахаров. Результатом их ключевой значимости в метаболизме биологически активных соединений является то, что некоторые из ПЛФ-зависимых ферментов широко используются в качестве мишеней для лекарственных средств [2,3].

ПЛФ-зависимая метионин-у-лиаза (МГЛ, К.Ф. 4.4.1.11) катализирует у-элиминирование L-метионина с образованием метантиола, а-кетобутирата и аммиака. МГЛ была найдена во многих бактериях и одноклеточных эукариотах, в том числе и патогенных, таких как Clostridium sporogenes, Treponema denticola, Phorphyromonas gingivalis, Entamoeba hystolytica, Trichomonas vaginalis. Отсутствие фермента в клетках млекопитающих указывает на то, что МГЛ представляет значительный интерес в связи с возможностью использования его в качестве биохимической мишени для рационального дизайна антипатогенных лекарственных средств.

МГЛ — один из наименее изученных ПЛФ-зависимых ферментов. Впервые она была выделена и частично очищена из Pseudomonas putida японскими исследователями в 1977 г. Немногочисленные данные о реакционной и субстратной специфичности МГЛ получены для фермента из Р. putida, Т. vaginalis и Citrobacter freundii.

Целью данной работы являлось изучение механизма реакции у-элиминирования L-метионина, катализируемой ПЛФ-зависимой МГЛ С. freundii. В работе решались следующие задачи: 1) определение стационарных кинетических параметров взаимодействия МГЛ с рядом аминокислотсубстратов и потенциальных ингибиторов и исследование вклада стадий обмена С-аи С-р-протонов ингибиторов в ферментативную реакцию- 2) получение кристаллов холофермента, дающих высокое рентгенографическое разрешение- 3) спектральная идентификация интермедиатов, образуемых ферментом с субстратами и ингибиторами в растворе и кристалле.

I. ПЛФ-зависимые ферменты, участвующие в метаболизме серосодержащих аминокислот, как мишени для рационального дизайна новых лекарственных средств.

выводы.

1. Определены константы скоростей катализируемого метионин — у-лиазой обмена С-аи С-Р-протонов ряда ингибиторов на дейтерий и кинетический изотопный эффект дейтериевой метки в С-а-положении ингибиторов на скорости обмена их С-Р-протонов. Не обнаружено стереоселективности при обмене С-Р-протонов и заметного изотопного эффекта дейтерия в С-а-положении на скорость обмена С-р-протонов.

2. Данные стационарной кинетики реакции у-элиминирования ряда субстратов, содержащих различные уходящие группы, спектральные характеристики фермент-субстратных комплексов и данные о скоростях обмена С-аи С-р-протонов ингибиторов фермента позволяют предположить, что скорость-лимитирующей стадией реакции у-элиминирования является стадия дезаминирования аминокротоната.

3. Получены кристаллы холофермента метионин — у-лиазы, дающие разрешение 1,35 А. Определены ионный и таутомерный составы внутреннего альдимина в кристаллическом состоянии.

4. Внешний альдимин (основание Шиффа ПЛФ с аммиаком) идентифицирован в кристаллах холофермента метионин — у-лиазы, полученных в присутствии сульфата аммония.

5. Исследовано взаимодействие метионин — у-лиазы с субстратами и ингибиторами в кристаллическом состоянии. Показано, что кристаллы метионин — у-лиазы каталитически компетентны.

III. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Выращивание бактериальной массы, выделение и очистка фермента.

Клетки E. coli BL21 (DE3), содержащие ген МГЛ из С. freundii в плазмиде pET-mgl, выращивали в колбах объемом 2 л, содержащих 1 л «индуцирующей» среды (1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,012% MgS04, 0,05% глицерина, 0,005% глюкозы, 0,02% лактозы, 0,033% сульфата аммония, 0,068% КН2РО4, 0, 07% ]МагНР04), с добавлением 0,01% ампицилина. Выращивание клеток проводили при 37° с перемешиванием (180 об/мин) 24 часа. Клетки собирали центрифугированием в течение 30 минут при 12 000 об/мин. при 4° и хранили при -80°. Из 1 л среды получали в среднем около 3 г клеточной массы.

Клетки суспендировали в 0,1 М калий-фосфатном буфере, pH 8,0, содержащим 0,1 мМ ПЛФ, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитол и разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-А (15−20 кГц) при охлаждение в течение 4−5 минут. До и после разрушения клеток к суспензии добавляли раствор фенилметансульфонилфторида до конечной концентрации 0,001 М. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием в течение 30 минут при 18 000 об/мин.

Осаждение нуклеиновых кислот в клеточном экстракте проводили при комнатной температуре протаминсульфатом из расчета 0,14 мг на 1 мг белка. Суспензию центрифугировали в течение 20 минут при 15 000 об/мин, осадок отбрасывали. Полученный раствор белка наносили на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную 0,1 М калий-фосфатном буфером, pH 8,0, содержащим 0,1 мМ ПЛФ, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитол. Фермент элюировали ступенчатым градиентом хлористого калия в буфере того же состава, изменяя концентрацию хлористого калия от 0,1 М до 0, ЗМ. Активные фракции фермента собирали и концентрировали на ячейках для концентрирования Vivaspin 2 (30,000 MWCO) фирмы «VIVASCIENCE». Концентрированный раствор фермента (20−30 мг/мл) наносили на колонку с супердексом S-200, уравновешенную 0,1 М калий-фосфатном буфером, pH 8,0, содержащим 0,1 мМ ПЛФ, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитол. Фермент элюировали тем же буфером. После хроматографии очищенный белок хранили при -20°С.

3.2. Определение концентрации белка.

Определение концентрации белка в процессе очистки проводили по методу Лоури, с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта [130]. Концентрацию чистого фермента определяли спектрофотометрически, измеряя поглощение при 278 нм и используя коэффициент поглощения 0,1% раствора МГЛ, рассчитанный, исходя из определения концентрации препаратов по методу Лоури [130] и соответствующих значений поглощения при 278 нм, равный 0,8.

3.3. Определение активности фермента.

Активность МГЛ в процессе очистки определяли, используя в качестве субстрата S-этил-Ь-цистеин, измеряя скорость образования пирувата в сопряженной реакции с лактатдегидрогеназой по снижению поглощения NADH при 340 нм (Ав= 6220 М-1см-1) при 30°. Реакционная смесь содержала 100 мМ калий-фосфатный буфер (рН 8,0), 0,1 мМ ПЛФ, 5 мМ дитиотреитол, 0,2 мМ NADIi, 10 единиц лактатдегидрогеназы и 2,5 мМ S-этил-Ь-цистеин. За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1,0 мкМ/мин пирувата.

3.4. Определение чистоты выделенного фермента.

Чистоту полученного препарата проверяли при помощи Ds-Na-ПААГ-электрофореза по методу Лэммли [131]. В качестве стандарта использовали смесь белков с известным молекулярным весом фирмы «Sigma». Препараты фермента 95% чистоты имели удельную активность 12 ед/мг.

3.5. Получение 2-[2Н]-аминокислот л.

2-[ Н]-Аминокислоты были получены из соответствующих недейтерированных аналогов ферментативным методом, используя триптофан-индол-лиазу по методике, описанной ранее [132].

3.6. Кинетические исследования.

При определении кинетических параметров реакции у-элиминирования реакционные смеси содержали 100 мМ калий-фосфатный буфер (рН 8,0), 0,1 мМ ПЛФ, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитол и варьируемые количества субстратов. Скорость ферментативной реакции определяли по скорости образования а-кетобутирата с помощью динитрофенилгидразина [133]. Реакцию инициировали добавлением 1−5 мкг фермента. Смесь инкубировали 15 мин при 30°, останавливали реакцию добавлением трихлоруксусной кислоты до конечной концентрации 12,5% (m/V).

Исследование ингибирования реакции у-элиминирования L-метионина различными аминокислотами исследовали в условиях, описанных выше.

Кинетику реакций обмена С-аи С-Р-протонов ингибиторов на дейтерий, катализируемые МГЛ, исследовали методом спектроскопии ЯМР 'Н. Реакционная смесь содержала 0,05 М калий-фосфатный буфер, pD 7,6, 2 мг/мл соответствующего ингибитора в 0,5 мл D2O. Реакция инициировалась добавлением 0,01 мл раствора фермента (0,5 мг/мл) к реакционной смеси при 37°. Спектры ЯМР 1Н записывали на спектрометре Bruker AMXIII-400 с рабочей частотой 400 МГц. С помощью специально разработанной программы автоматизации производили запись серии спектров через определенные интервалы времени. Сигналы аи p-протонов интегрировали с помощью модифицированной программы автоматизации «enzkin», входящей в состав XWIN-NMR программ.

Принимая Кт равным К для конкурентного ингибирования реакции с L-метионином и определив соотношение [S]o/([S]o-[P]o) из спектра ЯМР скорость дейтерообмена рассчитывали из интегральной зависимости степени превращения субстрата от времени с учетом ингибирования продуктом [134] с использованием уравнения:

Vmax= (iCm+[S]0)/t * ln ([S]o/([S]o-[P]), где [S]o — концентрация ингибитора, [Р] - концентрация продукта, t-время инкубации.

Параметры стационарной кинетики — константу Михаэлиса (Кт) и константу скорости (&cat) — определяли, применяя программу нелинейных квадратов Enzfitter (Elsevier Biosoft) [135], с использованием уравнения Михаэлиса — Ментен:

V= itcat[E]o[S]/(^m+[S]), где [S] - концентрация субстрата, [Е]о — концентрация фермента. В расчетах использовали величину молекулярной массы субъединицы фермента, равную 43 кДа.

Значения констант ингибирования (К{) определяли, применяя программу Enzfitter (Elsevier Biosoft) [134], с использованием уравнения:

V=Vmax[S]/(^m (l + [I]/^i) + [S]), где [I] - концентрация ингибитора. Данные обрабатывали в координатах Диксона [136].

3.7. Спектральные исследования фермента.

Спектры поглощения холофермента и его комплексов с субстратами и ингибиторами в растворе регистрировали при 25° на спектрофотометре Сагу-50 («Varian», США). Спектры кругового дихроизма снимали на дихрографе Mark III («Yobin-Yvon», Франция) и портативном дихрометре СКД-2 (Институт спектроскопии РАН, г. Троицк, МО). Концентрация фермента составляла 1−2 мг/мл. Концентрации субстратов и ингибиторов в пробах имели значения, на один порядок превышающие величины Кт (K?) для исследуемых аминокислот. Спектры записывали в 100 мМ калий-фосфатном буфере, рН 8,0.

Содержание ПЛФ в препарате фермента определяли в 0,1 M NaOH по методу Петерсона и Собера [137], используя значение молярного коэффициента поглощения ПЛФ при 390 нм, равное 6600 М~1см1 .

3.8. Кристаллизация МГЛ.

Кристаллы МГЛ были получены с использованием метода висячей капли при 30 °C. Капли содержали 1,5 мкл раствора фермента с концентрацией 20 мг/мл, диализованного против 50 мМ буфера Tris-HCl, рН 8,5, содержащего 0,5 мМ ПЛФ, 0,2 мМ дитиотреитол, и 1,5 мкл осаждающего раствора (35 — 37% PEG MME 2000, 50 мМ Tris-HCl, рН 8,5, 0,2 мМ ПЛФ, 25 мМ дитиотреитол) в присутствии или отсутствии 200 мМ сульфата аммония в качестве осадителя. Капли помещались на силиконированных покровных стеклах и уравновешивались против 1 мл того же осаждающего раствора. Кристаллы ромбической формы появлялись через неделю и достигали размеров 0,3−0,4 мм в течение двух недель.

Перед сбором дифракционных данных кристаллы переносили в крио-раствор (37% PEG MME 2000, 50 мМ Tris-HCl, pH 8,5, 0,2 мМ ПЛФ, 25 мМ дитиотреитол и 200 мМ сульфата аммония (для кристаллов выращенных в его присутствии)) и замораживали в жидком азоте.

Данные были собраны от одного монокристалла на синхротронном пучке РХ BW7B накопительного кольца DORIS на станции DESY (EMBL, Гамбург, Германия), для измерения интенсивностей отражений использовался MAR 345 мм детектор, данные обрабатывались с помощью XDS-программы [138]. Кристаллы принадлежали к пространственной группе 1222, с параметрами элементарной ячейки а=56,45 A, b=122,80 A, с=127,92 A (для кристаллов, выращенных в отсутствие сульфата аммония) и а=56,69 A, Ь= 122,80 A, с=128,04 A (для кристаллов, выращенных в присутствии сульфата аммония).

Структуры были определены методом молекулярного замещения с помощью программного комплекса PHENIX [139]. В качестве исходной модели была использована ранее определенная нами структура МГЛ из С. freundii с разрешением 1.85 A (PDB ID 1Y4I). Структуры были депонированы в банк данных белковых структур (PDB ID 3MKJ, 2RFV).

Комплекс с L-циклосерином был получен настаиванием кристаллов холофермента МГЛ, выращенных в отсутствие сульфата аммония, в крио-растворе, содержащим 40 мМ L-циклосерина в течение 7 минут. Данные собирались и обрабатывались по схеме описанной выше. Кристаллы принадлежали к пространственной группе 1222, с параметрами элементарной ячейки а=56,27 A, b=122,89 A, с=126,61 A. Координаты комплекса МГЛ с L-циклосерином не депонированы в банк данных белковых структур.

3.9. Микроспектрофотометрические исследования кристаллов МГЛ.

Кристаллы для микроспектрофотометрии были выращены в условиях, описанных выше в присутствии (отсутствие) сульфата аммония. Спектры поглощения поляризационного света регистрировались на микроспектрофотометре Zeiss МРМОЗ UV-vis, оборудованном объективами.

10-и кратного увеличения [140,141]. Для получения линейно поляризованного света параллельного направлению энкстинции в кристалле, был использован поляризатор Глена-Томпсона. Для правильной ориентации кристалла использовался второй поляризатор. Интенсивность поглощения вдоль перпендикулярных направлений варьировалась в зависимости от ориентации.

78 дипольного момента перехода электронов хромофоров в пределах асимметрической кристаллической решетки [142]. Отношение поглощения как функции длины волны называется поляризационным отношением. Измерения проводились при температуре 20°. Кристаллы суспендировались в стабилизирующем растворе того же состава, что и кристаллизационная среда с увеличением содержания PEG MME 2000 до 40%. Спектры поглощения были преобразованы с использованием логнормальных кривых [143−144−145] по описанной ранее процедуре [146- 147].

Показать весь текст

Список литературы

Heyl, D., Luz, E., Harris, S.A., Folkers, К. Phosphates of the vitamin B6 group. The structure of codecarboxylase. (1951) J. Am. Chem. Soc., 73, 3430−3433.
Robertson, J.G. Mechanistic basis of enzyme-targeted drugs (2005) Biochemistry, 44, 5561−5571.
Olivard, J., Mctzler, D.E., Snell, E.E. Catalytic Racemization of Amino Acids by Pyridoxal and Metal Salts (1952) J.Biol. Chem., 199, 669−674
Metzler, D.E., Snell, E.E. Some transamination reactions involving vitamin-B6 (1952) J.Am.Chem.Soc., 74, 979−983.
Браунштейн A. E., Шемякин M. M. Теория процессов аминокислотного обмена, катализируемых пиридоксалевыми ферментами. (1953). Биохимия, 18, 393—411.
Metzler, D.E., Ikawa, М., Snell, E.E. A general mechanism for vitamin B6 -catalyzed reactions (1954) J.Am. Chem. Soc., 74, 648−652.
Snell, E.E. Pyridoxal phosphate in nonenzymic and enzymic reactions. In Transaminases, Christen, P., Metzler, D.E., Eds.- Wiley-Interscience: New York, 1985, 19−30.
Eliot, A.C., Kirsh, J.F. Pyridoxal phosphate enzymes: mechanistic, structural, and evolutionary considerations (2004) Annu.Rev.Biochem., 73, 383−415.
John, R.A. Pyridoxal phosphate-dependent enzymes (1995) BBA, 1248, 8196.
Soda, K., Yoshimura, Т., Esaki, N. Stereospecificity for the hydrogen transfer of pyridoxal enzyme reactions (2001) Chem.Rec., 1, 373−384.
Hayashi, H. Pyridoxal enzymes: mechanistic diversity and uniformity (1995) J. Biochem (Tokyo), 118, 463−473.
Jansonoius, J.N. Structure, evolution and action of vitamin B6-dependent enzymes. (1998) Curr.Opin.Struct.Biol., 8, 759−769.
Dunathan H.C. Conformation and reaction specificity in pyridoxal phosphate enzymes. (1966) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 55, 712−716.
Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке. М., Мир, 1980, т.2, с. 75.
Ivanov, V.I., Karpeisky, M.Ya. Dynamic three-dimensional model for enzymic transamination (1969) Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 32, 21−53.
Capitani, G., McCarthy, D.L., Gut, H., Grutter, M.G., Kirsch, J.F. Apple ACC Synthase in. Complex with the Inhibitor L-aminoethoxyvinylglycine: Evidence for a Ketimine Intermediate. (2002). J.Biol.Chem., 277, 49 735−49 742.
Fu, M., Nikolic, D., Van Breemen, R.B., Silverman, R.B. Mechanism of inactivation of y-aminobutyric acid aminotransferase by (S)-4-amino-4,5-dihydro-2-thiophenecarboxylic acid. (1999) J.Am.Chem.Soc., 121, 77 517 759.
Christen, P., Metzler, D.E., eds. (1985) Transaminases, New York: Wiley.
Likos, J.J., Ueno, H., Feldhaus, R.W., Metzler, D.E. A novel reaction of the coenzyme of glutamate decarboxylase with L-serine O-sulfate. (1982) Biochemistry, 21, 4377−4386.
Kishore, G.M. Mechanism-based inactivation of bacterial kynureninase by betasubstituted amino acids. (1984) J.Biol. Chem., 259, 10 669−10 674.
Rando, R.R. Irreversible inhibition of aspartate aminotransferase by 2-amino-3-butenoic acid. (1974) Biochemistry, 13, 3859−3863.
Abels, R.H., Walsh, C.T. Acetylenic-Enzyme inactivators: inactivation of y-cystathionase in vitro and in vivo by propargylglycine (1973) J.Am.Chem.Soc. 95, 6124−6125.
Nanavati, S.M., Silverman, R.B. Mechanisms of inactivation of y-aminobutyric acid aminotransferase by the antiepilepsy drug y-vinyl GAB A (Vigabatrin). (1991) J.Am.Chem.Soc., 113, 9341−9349.
Miles, E.W. A new type of pyridoxal-P enzyme catalyzed reaction: the conversion of P, y-unsaturated amino acids to saturated a-keto acids by tryptophan synthase. (1975) Biochem.Biophys.Res.Commun., 66, 94−102.
Jung, M.J., Seiler, N. Enzyme-activated irreversible inhibitors of L-ornithine:2-oxoacid aminotransferase. (1978) J.Biol.Chem., 253, 7431−7439.
Munford, J.P., Cannon, D.J. Vigabatrin. (1994) Epilepsia, 35, 25−28.
Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D.G. The CLUSTALX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools (1997) Nucleic Acids Research, 24, 4876−4882.
Nicholas, K.B., Nicholas H.B. Jr., Deerfield, D.W. II. GeneDoc: analysis and visualization of genetic variation. (1997), EMBNEW. NEWS, 4, 14.
Yamagata, S. O-Acetylhomoserine thiolase of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe: partial purification, characterization, and its probable role in homocysteine biosynthesis. (1984) J. Biochem., 96, 15 111 523.
Ozaki, H., Shiio, I. Methionine biosynthesis in Brevibacterium flavum: properties and essential role of O-acetylhomoserine sulfhydrylase. (1982) J. Biochem., 91, 1163−1171.
Umbarger, H.E. Amino acid biosynthesis and its regulation. (1978), Annu.Rev. Biochem., 47, 532−606.
Giovanelli, J., Mudd, S.H., Datko, A.H. Sulfur amino acids in plants. In The Biochemistry of Plants: A Comprehensive Treatise, Stumpf, P.K., Conn, E.E., Eds.- Academic Press: New York, 1980, 5, 453−505.
Guggenheim, S., Flavin, M. Cystathionine y-synthase. A pyridoxal phosphate enzyme catalyzing rapid exchanges of P- and a-hydrogen atoms in amino acids. (1969) J.Biol.Chem., 244, 6217−6227.
Clausen, T., Huber, R., Prade, L., Wahl, M.C., Messerschmidt, A. Crystal structure of Escherichia coli cystathionine y-synthase at 1.5 A resolution. (1998) EMBO J., 17, 6827−6838.
Steegborn, C., Messerschmidt, A., Laber, B., Streber, W., Huber, R., Clausen, T. The crystal structure of cystathionine y-synthase from Nicotiana tabacum reveals its substrate and reaction specificity. (1999) J.Mol.Biol., 290, 983−986.
Washtein, W., Abeles, R.H. Mechanism of inactivation of y-cystathionase by the acetylenic substrate analogue propargylglycine (1977) Biochemistry, 16, 2485−2491.
Jonston, M., Jankowski, D., Marcotte, P., Tanaka, H., Esaki, N., Soda, K., Walsh, C. Suicide inactivation of bacterial cystathionine y-synthase and methionine y-lyase during processing of propargylglycine. (1979) Biochemistry, 18, 4690−4701.
Datko, A.H., Mudd, S.H. Methionine biosynthesis in Lemna: inhibitor studies. (1982) Plant Physiol., 69, 1070−1076.
Turano, F.J., Wilson, K.G. Evaluation of acute toxitity of selected compounds in higher plants using cell culture. (1985) In Vitro, 21, 135−139
Steegborn, C., Laber, B., Messerschmidt, A., Huber, R., Clausen, T. Crystal structures of cystathionine y-synthase inhibitor complexes rationalize the increased affinity of a novel inhibitor. (2001) J.Mol. Biol., 311, 789−801.
Laber, B., Clausen, T., Huber, R., Messerschmidt, A., Enger, U., Muller-Fahrnow, A., Pohlenz, H.D. Cloning, purification, and crystallization of Escherichia coli cystathionine P-lyase (1996) FEBS Lett., 379,94−96.
Ejim, L.J., D’Costa, V.M., Elowe, N.H., Loredo-Osti, J.C., Malo, D., Wright, G.D. Cystathionine P-lyase is important for virulence of Salmonella enterica serovar Typhimuriam. (2004) Infect.Immun., 72, 3310−3314.
Gentry-Weeks, C.R., Spokes, J., Thompson, J. P-Cystathionase from Bordetella avium. Role (s) of lysine 214 and cysteine residues in activity and cytotoxicity (1995) J.Biol.Chem., 270, 7695−7702.
Ravanel, S., Job, D., Douce, R. The purification and characterization of cystathionine P-lyase from Arabidopsis thaliana overexpressed in Escherichia coli. (1996) Biochem.J., 320, 383−392.
Staton, A.L., Mazelis, M. The C-S lyases of higher plants: homogeneous (3-cystathionase of spinach leaves. (1991) Arch.Biochem. Biophys., 290, 46−50.
Parston, C., Saint-Girons, I., Cohen, G.N. Enzyme specialization during the evolution of amino-acid biosynthetic pathways. (1987) Microbiol.Sci., 4, 258−262.
Clausen, T., Huber, R., Laber, B., Pohlenz, H.D., Messerschmidt, A. Crystal structure of the pyridoxal-5'-phosphate dependent cystathionine P-lyase from Escherichia coli at 1.83 A. (1996) J.Mol.Biol., 262, 202−224.
Breitinger, U., Clausen, T., Ehlert, S., Huber, R., Laber, R., Schmidt, F., Pohl, E., Messerschmidt, A. The three-dimensional structure of cystathionine P-lyase from Arabidopsis and its substrate specificity. (2001) Plant Physiol., 126, 631−642.
Silverman, R.B., Abeles, R.H. Inactivation of pyridoxal phosphate dependent enzymes by mono- and polyhaloalanines. (1976) Biochemistry, 15, 4718−4723.
Clausen, T., Huber, R., Messerschmidt, A., Phlenz, H.D., Laber, B. Slow-binding inhibition of Escherichia coli cystathionine p-lyase by L-aminoethoxyvinylglycine: a kinetic and X-ray study. (1997) Biochemistry, 36, 12 633−12 643.
Owens, L.D., Guggenheim, S., Hilton, J.L. Rhizobiumsynthesized phytotoxin: an inhibitor of P-cystathionase in Salmonella typhimurium. (1968) BBA, 158, 219−225.
Giovanelli, J., Owens, L.D., Mudd, S.H. In vivo inactivation by rhizobitoxine and role of the enzyme in methionine biosynthesis in corn seedlings. (1973) Plant Physiol., 51, 492−503.
Rando, R.R. Mechanisms of action of naturally occurring irreversible enzyme inhibitors (1975) Acc.Chem. Res., 8, 281−288.
Minamisawa, K., Fukai, K., Asami, T. Rhizobitoxine inhibition of hydrogenase synthesis in free-living Bradyrhizobium japonicam. (1990) J.Bacteriol., 172, 4505−4509.
Uren, J.R., Ragin, R., Chaykovsky, M. Modulation of cysteine metabolism in mice-effects of propargylglycine and L-cysteine-degrading enzymes (1978) Biochem.Pharmacol., 27, 2870−2814.
Chu, L., Burgum, A., Kolodrubetz, D., Holt, S.C. The 45-kilodalton-hemolysin gene from Treponema denticola encodes a novel hemolysin homologous to aminotransferase. (1995) Infect. Immun., 63, 4448−4455.
Chu, L., Ebersole, J.L., Kurzban, G.P., Holt, S.C. Cystalysin, a 46-kDa L-cysteinedesulfhydrase from Treponema denticola: biochemical and biophysical characterization. (1999) Clin. Infect. Dis., 28, 442−450.
Krupka, H.I., Huber, R., Holt, S.C., Clausen, T. Crystal structure of cystalysin from Treponema denticola: a pyridoxal 5'-phosphate-dependent protein acting as a haemolytic enzyme. (2000) EMBO J., 19, 3 168−3 178.
Bertoldi, M., Cellini, B., Clausen, T., Voltattorni, C.B. Spectroscopic and kinetic analyses reveal the pyridoxal 50 -phosphate binding mode and the catalytic features of Treponema denticola cystalysin. (2002) Biochemistry, 41, 9153−9164.
Cellini, B., Bertoldi, M., Montioli, R., Borri Voltattorni, C. Probing the role of Tyr 64 of Treponema denticola cystalysin by site-directed mutagenesis and kinetic studies (2005) Biochemistry, 44, 13 970−13 980.
Bertoldi, M., Cellini, B., Paiardini, A., Di Salvo, M., Borri Voltattorni, C. Treponema denticola cystalysin exhibits significant alanine racemase activity accompanied by transamination: mechanistic implications.2003) Biochem. J., 371, 473−483.
Cellini, B., Bertoldi, M., Paiardini, A., D’Aguanno, S, Voltattorni, C.B. Site-directed mutagenesis provides insight into racemization and transamination of alanine catalyzed by Treponema denticola cystalysin.2004) J. Biol. Chem., 279, 36 898−36 905.
Cellini, B., Bertoldi, M., Borri Voltattorni, C. Treponema denticola cystalysin catalyzes P-desulfination of L-cysteine sulfinic acid and p-decarboxylation of L-aspartate and oxalacetate. (2003) FEBS Lett., 554, 306−310.
Taoka, S., Ohja, S., Shan, X., Kruger, W.D., Banerjee, R. Evidence for heme-mediated redox regulation of human cystathionine P-synthase activity, (1998) J.Biol. Chem., 273, 25 179−25 184.
Meier, M., Janosik, M., Kery, V., Kraus, J.P., Burkhard, P. Structure of human cystathionine P-synthase: A unique pyridoxal 5'-phosphate dependent hemeprotein. (2001) EMBO J., 20, 3910−3916.
Frank, N., Kery, V., Maclean, K.N., Kraus, J.P. Solvent accessible cysteines in human CBS: The role of Cysteine 431 in AdoMet binding. (2006) Biochemistry, 45, 11 021−11 029.
Hajjar, K.A. Homocysteine: a sulphurous fire. (2001) J. Clin. Invest., 107, 663−664.
Qu, K., Chen, C.P., Halliwell, B., Moore, P.K., Wong, P.T. Hydrogen sulfide is a mediator of cerebral ischemic damage. (2006) Stroke, 37, 889 893.
Rabeh, W.M., Cook, P.F. Structure and mechanism of O-acetylserine sulfhydrylase. (2004) J.Biol.Chem., 279, 26 803−26 806.
Kredich, N.M., Becker, M.A., Tomkins, G.M. Purification and characterization of cysteine synthetase, a bifunctional protein complex from Salmonella typhimurium. (1969) J. Biol. Chem., 244, 2428−2439.
Mino, K., Yamanoue, T., Esaky, N., Matsuyama, A., Nakanishi, K. Effects of bienzyme complex formation of cysteine synthetase from Escherichia coli on some properties and kinetics (2000) Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 1628−1640.
Droux, M., Ruffet, M.L., Douce, R., Job, D. Interactions between serine acetyl transferase and O-acetylserine (thiol) lyase in higher plants: structural and kinetic properties of the free and bound enzymes. (1998) Eur. J. Biochem./FEBS, 255, 235−245.
Cook, P.F., Wedding, R.T. Initial kinetic characterization of the multienzyme complex, cysteine synthetase. (1977) Arch. Biochem. Biophys., 178, 293−302.
Mino, K., Yamanoue, T., Eisaki, N., Matsuyama, A., Nakanishi, K. Purification and characterization of serine acetyltransferase from Escherichia coli partially truncated at the C-terminal region. (1999) Biosci. Biotechnol. Biochem., 63, 168−179.
Burkhard, P., Rao, G.S., Hohenester, E., Schnackerz, K.D., Cook, P.E., Jansonius, J.N. Three-dimensional Structure of O-acetylserine Sulfhydrylase from Salmonella typhimurium. (1998) J. Mol. Biol., 283, 121 133.
Burkhard, P., Tai, C.H., Jansonius, J.N., Cook, P.F. Identification of an allosteric anion-binding site on O-acetylserine sulfhydrylase: structure of the enzyme with chloride bound. (2000) J. Mol. Biol., 303, 279−286.
Burkhard, P., Tai, C.H., Ristroph, C.M., Cook, P.F., Jansonius, J.N. Ligand binding induces a large conformational change in O-acetylserine sulfhydrylase from Salmonella typhimurium. (1999) J. Mol. Biol., 291, 941 953.
Huang, B., Vetting, M.W., Roderick, S.L. The active site of O-acetylserine sulfhydrylase is the anchor point for bienzyme complex formation with serine acetyltransferase. (2005) J. Bacteriol., 187, 32 013 205.
Claus, M.T., Zocher, G.E., Maier, T.H.P., Schulz, G.E. Structure of the O-acetylserine sulfhydrylase isoenzyme CysM from Escherichia coli. (2005) Biochemistry, 44, 8620−8626.
Tai, C.H., Burkhard, P., Gani, D., Jenn, T., Johnson, C., Cook, P.F. Characterization of the allosteric anion-binding site of O-acetylserine sulfhydrylase. (2001) Biochemistry, 40, 7446−7452.
Mozzarelli, A., Bettati, S., Pucci, A.M., Burkhard, P., Cook, P.F. Catalytic competence of O-acetylserine sulfhydrylase in the crystal probed polarized absorption microspectrophotometry. (1998) J. Mol. Biol., 283, 135−146.
Hirase, K., Molin, W.T. Characterization of cysteine synthase in Echinochloa crus-galli L and its inhibition by substrate analogues (2001) Pest.Biochem.Phys., 69, 189−197.
Hirase, K., Molin, W.T. Effect of inhibitors of pyridoxal-5'-phosphate-dependent enzymes on cysteine synthase in Echinochloa crus-galli L. (2001) Pest.Biochem.Phys., 70, 180−188.
Warrilow, A.G.S., Hawkesford, M.J. Modulation of cyanoalanine synthase and O-acetylserine (thiol) lyases A and B activity by P-substituted alanyl and anion inhibitors. (2002) J. Exp. Bot., 368, 439−445.
Westrop, G.D., Goodall, G., Mottram, J.C., Coombs, G.H. Cysteine biosynthesis in Trichomonas vaginalis involves cysteine synthase utilizing o-phosphoserine. (2006) J. Biol. Chem., 281, 25 062−25 075.
Lockwood, B.C., Coombs, G.H. Purification and characterization of methionine y-lyase from Trichomonas vaginalis. (1991) Biochem.J., 279, 675−682.
Soda, K. Microbial sulfur amino acids: an overview. (1987) Methods Enzymol., 143, 453−459.
Finegold, S.M., Wexler, H.M. Present studies of therapy for anaerobic infections. (1996) Clin.Infect.Dis., 23, S9−14.
Goyer A, Collakova E, Shachar-Hill Y, Hanson AD. Functional characterization of a methionine y-lyase in Arabidopsis and its implicationin an alternative to the reverse trans-sulfuration pathway. (2007) Plant Cell Physiol., 48(2), 232−242.
Goodall, G., Mottram, J.C., Coombs, G.H., Laptom, A.J. (2000) PDB-Entry, 1E5E.
Goodall, G., Mottram, J.C., Coombs, G.H., Lapthorn, A.J. (2000) PDB-Entry, 1E5 °F.
Sato, D., Yamagata, W., Kamei, K., Nozaki, Т., Harada, S. Expression, purification and crystallization of L-methionine y-lyasc 2 from Entamoeba histolytica. (2006) Acta Cryst., F62, 1034−1036.
Mamaeva, D.V., Morozova, E.A., Nikulin, A.D., Revtovich, S.V., Nikonov, S.V., Garber, M.B., Demidkina, T.V. Structure of Citrobacter freundii L-methionine y-lyase. (2005) Acta Cryst., F61, 546−549.
Coombs, G.H., Mottram, J.C. Trifluoromethionine, a prodrug designed against methionine y-lyase-containing pathogens, has efficacy in vitro and in vivo against Trichomonas vaginalis. (2001) Antimicrob. Agents Chemother., 45, 1743−1745.
Tanaka, H., Esaki, N., Soda, K. A versatile bacterial enzyme: L-methionine y-lyase. (1985) Enzyme Microb. Technol., 7, 530−537.
Tanaka, H., Esaki, N., Soda, K. (1977) Biochemistry., 16, 100−106.
Tokoro, M., Asai, Т., Kobayashi, S., Takeuchi, Т., and Nozaki, T. Identification and characterization of two isoenzymes of methionine y-lyase from Entamoeba histolytica. (2003) J. Biol. Chem. 279, 42 717−42 727.
Манухов И.В., Мамаева Д. В., Морозова Е. А., Расторгуев С. М., Фалеев Н. Г., Демидкина Т. В., Завильгельский Г.Б. L-метионин- у-лиаза Citrobacter freundii: клонирование гена и кинетические параметры фермента. (2006) Биохимия, 71, 454−463.
Esaki, N., Nakayama, Т., Sawada, S., Tanaka, H., Soda, К. 1H NMR studies of substrate hydrogen exchange reactions catalyzed by L-methionine y-lyase. (1985) Biochemistry, 24 (15), 3857−3862.
Inoue, H., Inagaki, K., Adachi, N., Tamura, Т., Esaki, N., Soda, K., Tanaka, H. Role of Tyrosine 114 of L-methionine y-lyase from Pseudomonas putida. (2000) Biosci. Biotechnol. Biochem., 64 (11), 2336−2343.
Фалеев Н.Г., Рувинов С. Б., Бахмутов В. И., Демидкина Т. В., Мягких И. В., Беликов В. М. (1987) Мол. биол., 21, 1636−1643.
Anatoly, P.D., Raimond, B.G.R., Alexander, N.P., Anastassios, S.P., Strain relief at the active site of phosphoserine aminotransferase induced by radiation damage. (2005) Protein Sci., 14, 1498−1507.
Bazhulina, N.P., Morozov, Yu.V., Papisova, A.I., Demidkina, T.V. Pyridoxal 5'-phosphate Schiff base in Citrobacter freundii tyrosine phenol-lyasc. Ionic and tautomeric equilibria. (2000) Eur.J.Biochem., 267, 18 301 836.
Davis, L., Metzler, D. Pyridoxal-linked elimination and replacement reactions. (1972) in: Boyer, P.D. (Ed). The Enzymes, vol. 7, Wiley and Sons, NY, 33−74.
Johnston, M., Raines, R., Chang, M., Esaki, N., Soda, K., Walsh, C. (1981) Biochemistry, 20, 4325−4333.
Yamagata, S., Yasugahira, Т., Okuda, Y., Iwama, T. (2003), J. Biochem., 134, 607−613.
Schnackers, K.D., Ehrlich, J.H., Giesemann, W., Reed, T.A. (1979) Biochemistry, 18, 3557−3563.
M. L. Svensson and S. Gatenbeck, The pathway of D-cycloserine biosynthesis in Streptomyces garyphalus. (1982) Arch. Microbiol., 131,129 131.
G. T. Olson, M. Fu, S. Lau, K. L. Rinehart and R. B. Silverman, An aromatization mechanism of inactivation of y-aminobutyric acid aminotransferase for the antibiotic L-cycloserine. (1998) J. Am. Chern. Soc., 120, 2256−2267.
R. R. Rando, On the mechanism of action of antibiotics which act as irreversible enzyme inhibitors. (1975) Biochem. Pharmacol, 24, 1153−1160.
T. D. Fenn, T. Holyoak, G. F. Stamper and D. Ringe, Effect of a Y265 °F Mutant on the Transamination Based Cycloserine Inactivation of Alanine Racemase. (2005) Biochemistry, 44, 5317−5327.
H. Ikushiro, Н. Hayashi and H. Kagamiyama Reactions of serine palmitoyltrasferase with serine and molecular mechanisms of the actions of serine derivatives as inhibitors. (2004) Biochemistry, 43, 1082−1092.
Malashkevich, V.N., Strop, P., Keller, J.W., Jansonius, J.N., Toney, M.D. Crystal structures of dialkylglycine decarboxylase inhibitor complexes. (1999) J.Mol.Biol., 294, 193−200.
Lowry, О. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with Folin phenol reagent. (1951) J. Biol. Chem., 193, 265 275.
Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. (1970) Nature, 227, 680−685.
Friedemann, Т. E., Haugen, G. E. The determination of keto acids in blood and urine. (1943) J. Biol. Chem., 177, 415−442.
Березин А.В., Клесов А. А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. (1976) М., МГУ, с. 168.
Cleland W. Statistical analysis of enzyme kinetic data. (1979) Methods. Enzymol., 63, 103−138.
Dixon, M. The determination of enzyme inhibitor constants. (1953) Biochem. J., 55, 170−171.
Peterson, E.A., and Sober, H.A. Preparation of crystalline phosphorylated derivatives of vitamin B6. (1954) J. Am. Chem. Soc., 76, 169−175.
Kabsch, W. Automatic processing of rotation diffraction data from crystals of initially unknown symmetry and cell constants. (1993) J.Appl. Cryst., 26, 795−800.
A. Mozzarelli, G.L. Rossi, Protein function in the crystal. (1996) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 25, 343−365.
A.R. Pearson, A. Mozzarelli, G.L. Rossi, Microspectrophotometry for structural enzymology, (2004) Curr. Opin. Struct. Biol., 14, 656−662.
J. Hofrichter, W.A. Eaton, Linear dichroism of biological chromophores. (1976) Annu. Rev. Biophys. Bioeng., 5, 51 1−560.
C.M. Metzler, D.E. Metzler, Quantitativa description of absorption spectra of pyridoxal phosphate-dependent enzyme using logonormal distribution curves. (1987) Anal. Biochem., 166, 313−327.
D.E. Metzler, C.M. Harris, R.J. Johnson, D.B. Saino, J.A. Thomson, Spectra of 3-hydroxypyridines. Band-shape analysis and evaluation of tautomeric equilibria. (1973) Biochemistry, 12, 5377−5392.
D.B. Siano, D.E. Metzler, Band shapes of the electronic spectra of complex molecules. (1969) J.Chem. Phys., 51, 1856−1861.
Y.V. Morozov, N.P. Bazhulina, V.A. Bokovoi, V.O. Chekhov, Principles of dissociation of complex spectra of biological active substances into bands corresponding to separate electron transitions, (1987) Biofizikan (Russian), 32, 699−715.
Y.V. Morozov, V.A. Bokovoi, Physical bases for spectroscopy deconvolution, (1989) Zhurnal Fizicheskoi Khimii (Russian), 63, 662−668.1. БЛАГОДАРНОСТИ
Выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю, Татьяне Викторовне Демидкиной, за чуткое руководство и внимание к моей работе, за ценные советы и рекомендации, сделанные в процессе подготовки диссертации.
Приношу свою глубокую благодарность Наталье Павловне Бажулиной, за помощь в совместной работе и обсуждении полученных результатов- Николаю Григорьевичу Фалееву за ценные советы в интерпретации полученных данных.
Благодарю всех сотрудников лаборатории химических основ биокатализа за дружескую обстановку, мудрые советы и помощь.
Отдельно хочу поблагодарить моих родителей и друзей за понимание, терпение и поддержку.

Заполнить форму текущей работой