Изучение биосинтеза траноферрина в печени крыс

Трансферрин /Тф/ - это белок плазмы крови позвоночных животных, играющий исключительно важную физиологическую роль. Способность Тф к обратимому связыванию железа лежит в основе его функций в транспорте железа в организме, Тф является донором железа для таких важных внутриклеточных гемопротеидов как гемоглобин, миоглобин, цитохромы, каталаза и др. Тф синтезируется, в основном, в печени млекопитающих, а у птиц белок, идентичный Тф по первичной структуре, кональбумин, синтезируется в эпителиальных клетках яйцевода и играет роль одного из преобладающих структурных компонентов яйца. Недостаточность Тф наследственной природы имеет следствием тяжелые нарушения кроветворения, функций печени и других внутренних органов.

Изучение молекулярной организации гена, кодирующего Тф, и механизмов его экспрессии до сих пор производилось, в основном, на яйцеводе птиц /125,43,93/. Лишь единичные работы, выполненные на млекопитающих, касаются биосинтеза Тф в интактной и перфузируемой печени /111,113/ и в бесклеточной системе /148/. В то же время детальные сведения о структуре гена Тф, его экспрессии и свойствах Тф-мРНК необходимы для понимания механизмов регуляции синтеза Тф в нормальном организме и недостаточности этого процесса при наследственных заболеваниях человека. Цели и задачи исследования:

Основной целью работы было изучение биосинтеза Тф в печени крысы. Предполагалось исследовать внутриклеточную топографию Тф-синтезирующих полирибосом, предпринять попытку препаративного выделения Тф-мРНК, исследовать ее физико-химические и функциональные свойства и использовать Тф-мРНК как матрицу для синте.

— 6 за комплементарной ДНК /вДНК/ в реакции обратной транскрипции. В конкретные задачи работы входило:

I/ выделить и охарактеризовать Тф из плазмы крови крыс и получить к нему моноспецифические антитела- 2/ произвести радиоиммунохимический анализ Тф-синтезирующих полирибосом печени крысы- 3/ выделить препаративно очищенную Тф-мРНК с использованием метода непрямой иммунопреципитации полирибосом с антителами к ТФ".

4/ охарактеризовать физико-химические свойства Тф-мРНК /степень гомогенности препарата, молекулярный вес, вторичную структуру, концевые группы/ и исследовать ее матричную активность в бесклеточном синтезе Тф и в реакции обратной, транскрипции;

5/ синтезировать однонитевую кДНК — обратный транскрипт Тф-мРНК и применить, ее как гибридизационный зонд для количественного определения стационарной концентрации Тф-мРНК в> печени крысы;

6/ произвести ферментативный синтез двухцёпочечной Тф-кДНК, интегрировать ее в плазмиду рВИ 3'22 и получить коллекцию трансформированных клонов Е"соИ,. несущих рекомбинантные плазмиды со вставками различных сегментов синтетического структурного гена Тф. Научная новизна работы:

В работе впервые охарактеризованы Тф-синтезирующие полирибосомы печени крысы и показано, что Тф синтезируется на мембра-носвязанных полирибосомах. Впервые выделена гомогенная Тф-мРНК млекопитающих, охарактеризован первичный продукт ее бесклеточной трансляции, определены ее молекулярная масса, размеры 3″.

— 7 концевых поли/А/-трактов и получена общая характеристика ее вторичной структуры. В реакции обратной транскрипции Тф-мРНК синтезирована одноцепочечная Тф-кДНК. Определена стационарная концентрация Тф-мРНК в печени крысы /6000−7000 молекул на клетку/. Произведен двухступенчатый синтез двухцепочечных Тф-кДНК путем обратной транскрипции Тф-мРНК и достройки второй нити ДНК с ДНК-полимеразой I. Получена коллекция клонов Е^соИ, несущих рекомбинантные плазмиды — дериваты 322 со вставками, соответствующими различным сегментам структурного гена Тф.

Научно-практическое значение полученных результатов:

Основным итогом работы является препаративное выделение препарата Тф-мРНК, гомогенной по ряду независимых критериев, а также — синтез кДНК — обратного транскрипта Тф-мРНК, и клонирование двухцепочечной кДНК в бактериальных клетках. Препарат высокоочищенной и функционально активной Тф-мРНК может быть использован для изучения реакций посттрансляционного созревания Тф в реконструированных бесклеточных системах. Наличие коллекции клонированных фрагментов структурного гена Тф является необходимой предпосылкой для дальнейшей работы по изучению молекулярной структуры и механизмов экспрессии гена 4.

Тф в нормальных клетках печени и при наследственных заболеваниях, связанных с недостаточностью синтеза Тф. Структура диссертации:

Диссертация состоит из введения, обзора литературы /главы 1−3/, материалов и методов исследования /глава 4/, собственных исследований /главы 5−8/, обсуждения результатов и выводов. Иллюстрирована 30 рисунками и 8 таблицами.

Список литературы

содержит 184 наименования /20 — отечественных ж 164.

Результаты работы Lee и др. /93/ были подтверждены экспериментами Perrin и др. /125/. Эти авторы показали, что последовательности, кодирующие Тф-мРНК, содержатся в трех фрагментах /" а", «ъ» и «с» / геномной ДНК птиц, причем в пре/ делах транскрипционной единицы они расположены следующим образом: 5″ - «ъ» — «с» — «а» -39. Методом гибридизации колоний с радиоактивной ДНК плазмиды pBR 322-Con I из трех независимо .

— 36 полученных библиотек генов птиц на Авекторе были выделены. клоны, несущие фрагменты «ъ» и «с» и часть фрагмента «а» гена Тф. В одном из этих клонов (.А С4-Соп I) обнаружена вставка, которая содержала 5*-последовательность мРНК с суммарной длиной 940 нуклеотидов. ДШ этого клона гибридизовали с Тф-мРНК в условиях образования н-петель, которые анализировали электронной микроскопией. Оказалось, что в гибриде ДНК фага Дс4-Со-п I с Тф-мРНК содержатся 6 интронов длиной 1306−125, 266−61, 1108−128, 134*35, 333*47 и 457*44 п.н. Семь экзонов, образующих гибриды с клонированным фрагментом, хромосомного гена Тф, имели длину 113*22, 174*20, 133*31, 197⁶, 145*21, 84*19 и 107*12 п.н. Таким образом, область природного гена, определяющая структуру менее половины молекулы Тф-мРНК с ее 5*-конца, превышает эту величину в 5 раз. Такие же отношения между длиной экзонов и интронов найдены и для ряда других индивидуальных генов.

Исчерпывающая картина молекулярной организации птичьего гена Тф была создана после клонирования полного фрагмента ЕсоШ — хромосомного гена /43/, который по данным электронной микроскопии гибридов ДНК-мРНК содержит 14 экзонов и соответственно — 13 интронов, разделяющих эти экзоны. Совокупность всех результатов изучения клонированных фрагментов гена Тф свидетельствует о том, что ген Тф представлен 17-ю экзонами и содержит 16 интронов /рис.3/. Общая длина экзонов гена Тф, по данным группы СЛштЪоп составляет 2508*164 п.н. Эта величина хорошо согласуется с опубликованными в 1982 г. результатами определения полной первичной структуры Тф-мРНК из яйцевода птиц /80/. По этим данным, цепь Тф-мРНК состоит из 2376 нуклеотидов /не считая 3*-концевую полиаденилатную последовательность/.

Совокупность кодирующих сегментов гена Тгп локализована в.

Рис-3 Молекулярная организация гена транеферрина птиц Масштаб сверху — т.п.н. Цифры 1−17 — экзоны, латинские буквы А-Р — интроны С по данным /43/5 пределах сегмента хромосомной ДНК протяженностью 10,3 т. п-ш! /между 5*-концом экзона I и 3*-концом экзона 17/.- Этот вывод подтверждается и данными определения размеров ядерных предшественников Тф-мРНК, которые показали, что самый протяженный предшественник имеет длину цепи 9900−10 100 нуклеотидов /43/.

Изучение первичной структуры хромосомного гена Тф птиц в настоящее время только начато /43,80/. В литературе, имеются сведения о нуклеотидной последовательности экзона I, который кодирует 5*-нетранслируемую зону Тф-мРНК /от кепа до инициатор-ного АШкодона/, имеющую длину 76 нуклеотидов, а такжеучасток транслируемой зоны Тф-мРНК, определяющий почти всю сигнальную последовательность пре-Тф /14″ кодонов из 19/. В общем: виде этот результат подтверждает гипотезу о том, что каждый эк-зон кодирует определенный функциональный или структурный домен.

— 38 белкового продукта 'гена /19,47,43,142,167/. В частности, экзон I кодирует домен пре-Тф /сигнальную последовательность/, необходимый для векториального транспорта этого белка в клетке. Подобная ситуация описана таете для генов легких цепей иммуноглобулинов — 1-й экзон также кодирует 15 из 19 аминокислот сигнальной пре-последовательности /167,142/.

Таким образом, ген Тф птиц является одним из наиболее расщепленных генов, исследованных к настоящему времени. Он содержит 17 экзонов, характеризующихся незначительной протяженностью /50−200 н.п./. Интересно отметить, что в интроне С обнаружена одна из умеренно повторяющихся последовательностей, рассеянных по геному птиц, которой приписываются возможные регуляторные функции в экспрессии генов /43/.

На рис¿-4 представлена’схема молекулярной организации зрелой Тф-мРНК, построенная на основании результатов определения ее нуклеотидной последовательности /80/. О.

500 1000 1500 2000 2500 " ." «| «|.» «.

I «| «» I * «» «I «» «» I дис.

Рис. 4 Схема структуры зрелой мРНК трансферрина птиц /80/ Сверху масштаб — число нуклеотидов. Черная линиятранслируемая зона, заштрихованы 5" — и, 3"-нетранслиру-емые зоны.

Тф-мРНК имеет длину цепи 2376 нуклеотидов, не считая поли/А/.

7 с" тракта и инвертированного остатка т’о — компонента оконцевого кепа. На 3'-конце цепи Тф-мРНК имеется нетранслируемая последовательность незначительной длины /182 нуклеотида/, которая при прямом структурном анализе оказалась существенно короче, чем это предполагалось на основании сравнения длины цепи Тф-мРНК и молекулярного веса пре-Тф /39,92/. В з'-не-транслируемой зоне Тф-мРНК найдена каноническая последовательность ААиААА, локализованная на расстоянии 18 нуклеотидов от поли/А/ и играющая, как это предполагается, роль участка узнавания для поли/А/-полимеразы /80/. Длина 5'-нетранслируемой области Тф-мРНК составляет 76 нуклеотидов.

Таким образом, результаты изучения молекулярной архитектуры хромосомного гена Тф птиц показывают, что этот ген, подобно большинству исследованных эукариотических генов, имеет линейно-мозаичную структуру. Обращает на себя внимание множественность интронов и их существенная протяженность, превышающая в несколько раз суммарную длину кодирующих сегментов гена Тф. Такой тип структурной организации характерен и для ряда других структурных генов. Так, ген проуЦ-коллагена цыпленка имеет общую протяженность 42 т.п.н. и содержит 50 интронов. Кодирующая последовательность этого гена представлена короткими экзонами /длина 45−108 п.н., чаще всего — 54 п.н./ /181/. Предполагается, что такой сложно организованный ген проколла-гена в эволюции сформировался в результате многократных дупликаций элементарной кодирующей единицы протяженностью 54 п.н. Большим количеством интронов характеризуется также хромосомный ген вителлогенина птиц и амфибий /172/. Сопоставление мозаичной структуры гена Тф и доменной организации самого Тй позволяет также предполагать, что ген Тф сформировался в результате дупликации гена-пред шественника в эволюции /80,177,178/ или даже — квадрипликации раннего гена-предшественника.

Суммарная длина экзонов гена Тф достигает примерно 25°/ его общей протяженности. Для некоторых других генов доля экзонов составляет лишь 5−10% общей длины единиц транскрипции, а основная масса ДНК этих единиц приходится на очень длинные ин-троны. К таким генам относятся овальбуминовый ген и ген, кодирующий дигидрофолатредуктазу /35/.

Изучение молекулярной организации гена Тф представляет интерес в связи с тем, что у птиц этот ген активно экспрессиру-ется в двух органах — в печени и в яйцеводе. Однако, эти два органа отличаются друг от друга как по степени экспрессии гена Тф, так и по регуляции его функциональной активности. В яйцеводе экспрессия гена Тф находится под строгим контролем эстро-генных гормонов, которые лишь незначительно стимулируют синтез Тф в печени. В то же время недостаточность железа индуцирует синтез Тф и накопление Тф-мРНК в гепатоцитах и не влияет практически на экспрессию гена Тф в яйцеводе /104,105/. Поэтому выяснение особенностей молекулярной организации гена Тф в двух тканях представляло бы существенный интерес для понимания молекулярных механизмов, осуществляющих тканеспецифический позитивный контроль экспрессии гена Тф. Однако, до настоящего времени не выявлены какие-либо особенности молекулярной организации генов Тф в геноме печени и яйцевода, по данным рестрикцийнного картирования ДНК этих органов, или сравнительного анализа молекулярных размеров Тф-мРНК.

В серии работ группы Chambon клонированный ген Тф птиц был использован в качестве модельного объекта для изучения осо.

— 41 бенностей структурной организации 5* -фланкирующих районов эука-риотических генов и идентификации функционально существенных последовательностей этих районов, необходимых для адекватной инициации транскрипции.

Известно, что инициация транскрипции прокариотических генов происходит в результате связывания РНК-полимеразы с промо-торными последовательностями. Одна из них /блок Прибнова/ удалена на 10 нуклеотидов от точки начала синтеза РНК, другаяудалена на 35 нуклеотидов /129/. По-видимому, РНК-полимераза последовательно связывается с этими участками, причем ее комплекс с блоком Прибнова является более прочным и обеспечивает точность инициации.

В эукариотических клетках существуют три молекулярные формы ДНК-зависимых РНК-полимераз, — различающихся по матричной специфичности. РНК-полимераза I /или А/ транскрибирует гены рРНК, РНК-полимераза II /или В/ обеспечивает транскрипцию генов, кодирующих белки, т. е. синтез пре-мРНК. Наконец, РНК-полимераза III /или С/ транскрибирует гены тРНК, 5БрРНК и низкомолекулярных ядерных РНК /41/. В последние годы достигнуты существенные успехи в изучении структуры эукариотических промоторов и тонких механизмов, обеспечивающих специфичность инициации транскрипции. Этот прогресс обусловлен, во-первых, возможностью клонирования индивидуальных генов и их фланкирующих районов геномной ДНК и, во-вторых, созданием высокоэффективных систем бесклеточной транскрипции с участием РНК-полимераз II и III. Прежде всего, оказалось, что в 5"-фланкирующих областях большинства эукариотических генов, кодирующих белки и транскрибируемых РИК-полимеразой II, содержится универсальная АТ-богатая последовательность /прототипная последовательность ТАТАААА для.

— 42 кодирующей нити/, которая получила название ТАТА-блок, или последовательность Хогнесса-Голдберга /35,169,175/. ТАТА-блок найден более чем в 60 изученных генах. Строго консервативным элементом этого блока является тетрануклеотид TATA, однако при попарном сравнении некоторых эукариотических генов, не тлеющих эволюционной или функциональной общности, могут быть выявлены и более протяженные участки гомологии. Так, в 5*-флан-кирующих районах гена Тф птиц и поздней транскрипционной единицы аденовируса 2 найдена общая 12-нуклеотидная последовательность 5 — ctataaaagggg -3 /175/. Эта последовательность, так же как и ТАТА-блоки других генов обнаруживается на расстоянии 25−30 п.н. в 5*-направлении от стартовой точки транскрипции, которая в первом приближении совпадает с началом 1-го экзона.

Второй консервативный элемент первичной структуры 5*-фланкирующих районов большинства изученных эукариотических генов — это так называемый САТ-блок, который удален от старта транскрипции на 70 нуклеотидов. Предполагается, что блоки CAT и TATA являются пространственно разобщенными элементами промотора для РНК-полимеразы II. При этом САТ-блок обеспечивает эффективное связывание РНК-полимеразы II, а ТАТА-блок необходим для точной инициации транскрипции. Основные данные, доказывающие необходимость ТАТА-последовательности для точной инициации транскрипции, были получены в опытах по бесклеточной транскрипции гена Тф птиц и некоторых других клонированных генов. В работе Wasylyk и др. /175/ была изучена сравнительно эффективность бесклеточной транскрипции и точность инициации транскрипции генов Тф, овальбумина и ранних и поздних областей генома аденовируса 2 '/Ad-2/. Оказалось, что ТАТА-последова-тельность необходима для специфической инициации, т. е. для.

— 43 правильного выбора РНК-полимеразой II стартовой точки синтеза РНК. Эффективность транскрипции гена ТФ и поздней области Ай-2, содержащих 12-нуклеотидную общую ТАТА-последователь-ность, была одинаковой, тогда как ген овальбумина и ранняя область Act-2, не имеющие в ТАТА-блоке такой протяженной гомологичной зоны, транскрибировались менее эффективно. Относительно низкая эффективность транскрипции овальбуминового гена в бесклеточной системе представляет специальный интерес, т.к. в клетках яйцевода птиц при индукции эстрогенами именно этот ген транскрибируется с максимальной эффективностью.

С целью дальнейшего анализа роли ТАТА-блока в адекватной инициации транскрипции гена Тф были получены мутанты этого гена с изменениями структуры этой зоны. Прежде всего, был сконструирован мутант с точковой заменой Т—*G, так называемый «TAGA» -мутант /174/. С этой целью рестрикционный фрагмент Pst 5 — Pst б хромосомного гена Тф, несущий ТАТА-последователь-ность, субклонировали в однонитевом векторе fdl03 и затем гибридизовали с синтетическим Ii-членным олигодезоксинуклеоти-дом 5 — CTTTTCTAGAG, который играл роль праймера в реакции достройки второй нити с ДНК-полимеразой I. Этот праймер комплементарен ТАТА-последовательности клонированного фрагмента гена Тф за исключением остатка G в положении 9 праймера /подчеркнуто/. Полученную таким образом рекомбинантную молекулу, содержащую замену Т — G в одной из нитей, клонировали в E^coli. Клоны, несущие мутантную ta-GAпоследовательность, отбирали по характеру расщепления ДНК рестриктазой ХЪа1, т.к. в результате замены Т —G в ТАТА-последовательности образовался участок узнавания для этой эндонуклеазы. При сравнительном анализе продуктов бесклеточной транскрипции нормального.

— 44 фрагмента гена Тф и его tagaмутанта в бесклеточной системе с РНК-полимеразой II оказалось, что точковая замена Т * g в ТАТА-блоке резко снижает специфичность инициации транскрипции, которая для tagaмутанта составляла лишь Ъ% контрольной величины.

Резко выраженное влияние точковой замены Т—на взаимодействие ТАТА-блока с РНК-полимеразой может быть обусловлено двумя альтернативными механизмами действия этой мутации: I/ мутация изменяет первичную структуру ТАТА-блока, специфичность которой необходима для адекватной инициации транскрипции- 2/ мутация сопровождается изменением нуклеотидного состава ТАТА-блока, в частности, заменой АТ-пары на gcпару, и увеличением вследствие этого стабильности дуплекса ДНК, что может затруднять ее локальное расплетение при связывании с РНК-полимеразой.

Для однозначного ответа на эти вопросы был сконструирован ТААА-мутант ps" fc5 — Pst6 -фрагмента клонированного гена Тф, транскрипция которого также была изучена в бесклеточной системе /173/.

Авторы исходили из того, что ТААА-мутация — это трансверсия, которая не сопровождается изменениями нуклеотидного состава соответствующего блока и какими-либо сдвигами в стабильности дуплексной ДНК по отношению к расплетающим воздействиям. Оказалось, что точность инициации транскрипции ТААА-мутанта в 2 раза ниже, чем для TAGAмутанта. Таким образом, РНК-по-лимераза, узнает тленно первичную структуру ТАТА-блока, а не АТ-богатые участки, причем точковые нуклеотидные замены в этом блоке резко нарушают специфичность транскрипции. Результаты опытов с различными мутантами, несущими локальные делеции.

1−4 нуклеотида/ в ТАТА-блоке, подтвердили этот вывод /табл.2/.