Стереонаправленный синтез фрагментов внеклеточного полисахаридного адгезина Staphylococcus aureus

Бактерии Staphylococcus aureus — один из наиболее часто выявляемых «госпитальных» патогенов, вызывающий большое число заболеваний с высоким уровнем смертности [1]. Именно этот возбудитель является причиной заболеваний у пациентов с медицинскими имплантантами, при которых колонии S. aureus покрывают поверхности имплантантов биопленками, защищающими бактерии от взаимодействия с компонентами иммунной системы. Основным структурным элементом этих биопленок и одним из факторов вирулентности S. aureus является поли-р-(1—>6)-]Ч-ацетилглюкозамин (ПНАГ) [4]. При щелочном гидролизе ПНАГ был получен его дезацетилированный аналог (Д-ПНАГ), содержащий лишь около 15% N-ацетильных групп. В опытах на животных было показано, что иммунизация с использованием Д-ПНАГ, приводит к образованию гораздо большего количества защитных антител по сравнению с нативным ПНАГ [5]. В этих экспериментах антитела к Д-ПНАГ эффективно инициировали уничтожение различных штаммов S. aureus [5]. Появление защитных антител, способных связываться с Д-ПНАГ, было также обнаружено у пациентов, выздоравливающих после заболеваний, связанных с инфекцией S. aureus [6]. Таким образом, антистафилококковая активность антител против поли-Р-(1—>6)глюкозаминов напрямую связана со степенью N-ацетилирования последних. Однако при получении Д-ПНАГ из нативного ПНАГ с помощью щелочного гидролиза образуется гетерогенная смесь полисахаридов и истинная структура активных эпитопов, то есть фрагментов полисахаридной цепи, ответственных за образование защитных антител, остается неизвестной.

Для установления структуры эпитопов ПНАГ-антигенов, способных инициировать развитие защитного иммунитета, необходимы синтетические олиго-Р-(1—>6)-глюкозамины различной длины, содержащие N-ацетильные группы в заданных остатках глюкозамина.

Целью данной диссертационной работы являлась разработка эффективного метода синтеза олиго-Р-(1—"6)-глюкозаминов, различающихся длиной цепи (от пентадо ундекасахаридов), степенью Ы-ацетилирования и расстановкой остатков М-ацетилглюкозамина, а также проведение иммунохимических исследований для выявления олигосахаридов, способных наилучшим образом связываться с антителами, направленными на Д-ПНАГ.

Работа выполнена в лаборатории химии гликоконъюгатов (№ 52) Учреждения Российской академии наук Института органической химии имени Н. Д. Зелинского РАН. Диссертация состоит из 6 частей: введения, литературного обзора, посвященного поиску оптимальных олигосахаридных лигандов при конструировании конъюгированных углеводных вакцин третьего поколения, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитированной литературы.

Нумерация соединений дана арабскими цифрами жирным шрифтом, причем соединения, схемы и таблицы в части 2 «Литературный обзор» и в части 3 «Обсуждение результатов» нумеруются независимо.

Часть 2.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.4.

Заключение

.

Выбор синтетического олиго сахари дного лиганда — важный этап конструирования конъюгированной вакцины, так как именно олигосахарид является ответственным за антигенную специфичность иммунного ответа к конъюгату. Однако определение минимального углеводного фрагмента, способного индуцировать образование антител, распознающих нативный полисахарид патогенного микроорганизма, является непростой задачей, не имеющей стандартного решения. Можно лишь с уверенностью сказать, что для успешного поиска оптимального углеводного лиганда необходимо исследовать достаточно большую репрезентативную серию синтетических фрагментов и постараться получить наиболее полное представление о характере взаимодействия этих фрагментов с антителами к нативному полисахариду. При этом для адекватного моделирования взаимодействия олигосахаридных лигандов с антителами необходимо принимать во внимание пространственное строение как синтетических олигосахаридов, так и нативного полисахарида. Рассмотренные примеры свидетельствуют о том, что рациональное планирование серий иммунологических экспериментов, как правило, позволяет найти подходящий углеводный лиганд. Все приведённые примеры подтверждают перспективность разработки вакцин на основе синтетических олигосахаридов.

Часть 3.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1. Синтез гомоолигосахаридов. Исследование реакции терминированной олигомеризации.

Известно, что выделенный из природных источников поли-[3-(1—>6)-К-ацетилглюкозамин (ПНАГ) содержит до 10% остатков глюкозамина со свободными аминогруппами, а при его химическом дез-ТЧ-ацетилировании не удается достичь полного удаления 1Ч-ацетатов (их остаточное содержание в Д-ПНАГ составляет около 15%). По этой причине при изучении взаимодействия этих гетерогенных полисахаридов с антителами нельзя сделать однозначного заключения о том, какие именно остатки участвуют в связывании. Так, например, было показано, что антитела, которые способны связываться как с ПНАГ, так и с Д-ПНАГ обладают гораздо большей антистафилококковой активностью, чем антитела, которые способны узнавать только ПНАГ. Возможно, активные антитела связываются со свободными аминогруппами, количество которых гораздо больше в Д-ПНАГ. Однако подтвердить или опровергнуть эту гипотезу можно лишь с использованием синтетических соединений, содержащих в составе одной молекулы остатки глюкозамина, несущие либо все свободные (общая формула 1), либо все 1М-ацетилированные аминогруппы (общая формула 2). Поэтому на первом этапе работы необходимо было синтезировать эти две серии гомоолигосахаридов. В этом случае олигоглюкозамины различной длины необходимы для определения размера олигосахарида, корректно моделирующего фрагменты природных полисахаридов при взаимодействии с ПНАГ-специфичными антителами. Дальнейшие объекты для синтеза были определены на основе результатов иммунологических испытаний с участием первой серии соединений. п п.

До настоящего времени было опубликовано лишь несколько статей, посвященных синтезу олиго-Р-(1—>-6)-глюкозаминов. Были использованы различные подходы, такие, как твердофазный синтез [108], мультикомпонентное сочетание с использованием полимерных носителей [109], полимеризация 1,6-ангидропроизводных [110] и блочный синтез [111−113]. Некоторые из этих методов приводили к получению о лиго сахари дов (до нонасахаридов) с приемлемыми выходами, однако олигомеры были в основном получены в защищенной форме, а не в виде деблокированных производных, необходимых для биомедицинских исследований. Ни одна из опубликованных работ не демонстрирует методов синтеза спейсерированных или меченых соединений для биологических тестов in vivo и никто из авторов не проводил иммунологических испытаний с участием этих соединений.

В структурах гомоолигосахаридов 1 и 2 был предусмотрен спейсерный агликон, так как в дальнейшем мы предполагали получать на основе этих соединений конъюгаты, необходимые для иммунологических исследований. Для синтеза такого рода олигосахаридов возможны два различных подхода. Первый из них — это блочный синтез, в ходе которого происходит постепенное наращивание углеводной цепи. Второй — реакция олигомеризации, для которой используют бифункциональные мономеры, содержащие одновременно как гликозил-донорную, так и гликозил-акцепторную функции, и в процессе которой возможно образование набора олигосахаридов различной длины. В нашем случае для получения спейсерированных олигосахаридов необходимо проводить реакцию олигомеризации в присутствии спейсированного блока, который фиксируется на восстанавливающем конце растущей олигосахаридной цепи и тем самым обрывает её рост (так называемая «терминированная олигомеризация»). Селективно удаляемая N-защитная группа в агликоне позволяет освобождать аминогруппу, с помощью которой методом ионообменной хроматографии можно отделять терминированные (спейсерированные) олигомеры от нетерминированных перед их дальнейшим разделением на индивидуальные олигосахариды. Подход с применением терминированной олигомеризации представлялся нам наиболее технологичным, и в первую очередь мы планировали исследовать возможности применения этого метода.

Ti Bz в.

SEt С.

PhthN PhthN.

3 4.

PhthN 5 6.

Схема 1. a: AcCI, MeOH, CH2C12- b: 1) TrCl, пиридин, 2) BzCl, пиридинс: 90% водн. CF3COOH, CH2C12.

В качестве первого мономера для олигомеризации был синтезирован моносахаридный блок 6 (Схема 1), содержащий свободную гидроксильную группу при С-6 и тиоэтильную группу. Выбор Nи О-защитных групп был основан на эффективности их постановки и удаления, устойчивости в условиях реакций гликозилирования и способности обеспечивать необходимую стереоселективность образования ß—(l—>6)-гликозидных связей. Так, для защиты аминогруппы была выбрана фталоильная группа, а в качестве постоянных защитных групп для ОН-групп при С-3 и С-4 были выбраны бензоильные группы, так как они менее склонны к миграции, чем ацетильные.

Для использования в качестве терминирующего соединения первоначально было выбрано N-Fmoc производное 3-аминопропанола 7а, защитная группа которого может быть селективно удалена в присутствии фталимидной защиты. Модельная реакция гликозилирования показала, что выбранный нами блок является хорошим гликозилирующим агентом и позволяет получить спейсерированный моносахарид 8 с высоким выходом (Схема 2).

Однако основным продуктом реакции терминированной олигомеризации тиогликозида 6 в присутствии терминатора 7 (Схема 2, соотношение мономер: «терминатор» во всех опытах составляло 5:1) оказалось 1,6-ангидро производное 9, (выход 50%), наряду с которым с выходом 20% был выделен циклический дисахарид 10. Этот результат был довольно неожиданным, так как концентрация мономера в реакционной смеси была достаточно высока, то есть, сравнима с приводимыми в литературе условиями аналогичных успешных олигомеризаций [114, 115]. Следует отметить, что пиранозный цикл в соединении 9 имеет конформацию близкую к конформации ванны, о чем свидетельствуют константы спин-спинового взаимодействия (J1>2 0, J2<3 9.2, /3,4 8.1, J^s 0 и Jci, H3=^С5.нз 1−5). Возможно, такая конформация соединения 9 устойчива благодаря тому, что в этом случае объемные заместители при С-2, С-3 и С-4 пиранозного цикла находятся в экваториальных положениях.

АсО^ з] + НО^^-ИН!* ^^?^О^^МНРтос.

РЬИМ.

7аК = Ртос.

7Ьк = 2 8 (87%).

НО^.

Вг Вг.

7а.

0,2 экв.

ВхО^Т^^О МРЫИ.

9 (50%).

МРМЬ.

Вг Вг.

РМИЫ.

10 (20%).

5 0,2 экв. 11(55%) (15%) (10%).

Схема 2. а: N18, ТГОН, СН2С12, МБ 4АЬ: МеСШ, СН2С12, МБ 4А.

Мы предположили, что образование 1,6-ангидропроизводного 9 может быть следствием пространственного сближения С-1 и ОН-группы при С-6 в мономере 6. Поэтому следующим шагом была олигомеризация производного 5, содержащего тритильную группу (Схема 2), которая, как известно, не препятствует гликозилированию, но может создать стерический барьер для внутримолекулярной циклизации. В этом случае реакция привела к преимущественному образованию гликаля 11 наряду с циклическими продуктами 9 и 10.

Для изучения возможности олигомеризации более длинных мономеров, был осуществлен синтез дии трисахаридных производных. В их синтезе использовали моносахаридные блоки 14−16, полученные по альтернативной схеме (Схема 3), которая представлялась менее трудоемкой, чем схема синтеза тиогликозида 6. Производное глюкозамина 12 было последовательно подвергнуто тритилированию и бензоилированию с образованием аномерной смеси 13. Замыкание фталимидного цикла при нагревании в уксусном ангидриде и пиридине с последующим удалением тритильной группы привело к аномерной смеси бензоатов 14 и 16.

Чистые а-изомер 14 и (3-изомер 16 были выделены с помощью колоночной хроматографии. Ацетилированием гидрокси-производного 14 был получен 6-ацетат 15, который далее превращали в бромид 17, дальнейшее гликозилирование которым акцептора 6 привело к дисахариду 18 (Схема 4). Селективное удаление ацетильной группы в 18 кислотным метанолизом привело к б'-ОН-производному 19, из которого далее получали бромид 20.

РИШМ 16.

Схема 3. а: 1) ТгС1, пиридин, 2) ВгС1, пиридинЬ: АсгО, пиридинс: 90% водн. СРзСООН, СН2С12.

С участием полученных мономеров 19 и 20 и терминатора 7а была проведена серия реакций терминированной олигомеризации, в которых мы варьировали концентрацию мономеров, температуру, растворитель, уходящую группу и промотирующую систему. Все реакции с участием тиогликозида 19, а также реакции бромида 20 в присутствии трифлата серебра, приводили к практически количественному образованию цикла 10. Следует отметить, что ранее сообщалось об образовании аналогичных циклических производных глюкозы при олигомеризации 2,3,4-три-0-ацетил-6−0-(2,3,4-три-0-ацетил-р-0глюкопиранозил)-а-1>глюкопиранозилбромида также в присутствии солей ртути, однако выход циклического продукта составлял лишь 10% [116]. В наших экспериментах лишь в случае олигомеризации бромида 20 в условиях реакции Гельфериха, в которых образование цикла 10 не являлось основным направлением реакции, был проведен анализ образующихся продуктов. Для этого циклический продукт 10 был отделен с помощью колоночной хроматографии (его выход составил 30%). В оставшейся смеси, содержащей терминированные продукты 27а, селективно удаляли Ршос-защитную группу действием каталитического количества ОВи. Мы столкнулись со сложностью контролирования протекания данной реакции в случае олигомерной смеси и поэтому в следующих.

ВгО-А-О.

НОУтУ н, а «Ь'с «ВгО-^-О.

О рмнгЛ0Вк.

С02Н ^^СОгН.

12 13 |—14 = Н ьЦи5 Я = Ас экспериментах перешли к 7-замещенным производным, что не привело к изменению реакционной способности терминирующего блока (Таблица 1). Терминированные олигосахариды, содержащие в агликоне незащищенную аминогруппу 28, отделяли от нетерминированных с помощью ионообменной хроматографии. Далее смесь подвергали исчерпывающему гидразинолизу с образованием полностью деблокированных спейсерированных олигосахаридов 29, которые разделяли при помощи гель-хроматографии.

22 Р1 = аОВг, К2 = Ас.

23 К1 = Вг, ^ = Ас —, Ь.

7Ь.

1).

2) с.

ВгО-тЛ-Оч г ВгОУч"*? Vе РМИМ.

АсО-^.

РМИЫ Вг 17 на^.

PhthN.

21а = Ртос 2ЛЪк = г иЕ.ь.

2) с.

РМЬЫ.

18 Я1 = ЭЕ^ И2= Ас.

19 Я1 = БЕ^ Я2= Н.

20 Я1 = Вг, И2 = Н ыиг.

РИ"^ ВгОлД-О, ВгО^Т1 25 Я = ЗЕ1 РМИМ.

26 Я=Вг.

Схема 4. а: НВг, АсОН, СН2С12- Ь: HgBr2, Ня (СМ)2, СНзСИс: АсС1, МеОН, СН2С12- <3: Вг2, СН2С12.

В опыте с бромидом 20 и Ртос-замещенным аминопропанолом 7а, анализ которого был проведен согласно приведенной выше схеме, выход терминированных олигомеров составил 10% (Таблица 1, опыт № 1). В результате гель-хроматографии был получен лишь спейсерированный дисахарид 29 (п=1).

Столь низкое вовлечение в реакцию терминатора, возможно, является следствием различной реакционной способности гидроксильных групп в терминаторе и мономере. Чтобы приблизить реакционную способность акцепторной ОН-группы терминирующей молекулы к ОН-группе мономера, мы перешли к использованию терминаторов на основе моносахаридов 21а и 21Ь (Схема 4). Модельная реакция между дисахаридным бромидом 23 и терминатором 21а привела к образованию целевого трисахарида с выходом 85% (Схема 6, соединение 40). но.

Bzi Bz.

О^-О. zO V-t —" .

PhthN.

BzO^vV-O BzOWt V.—X PhthN.

— J П.

BzOvV-O.

BzO V*t ^.

PhthN.

— O^^NHR n.

HO^.

R^N r-'n.

O^x^NHR1 П.

20 n = 1, X = Br.

25 П = 2, X = SEt.

26 П = 2, X = Br.

7a n = 0, R = Fmoc 21a n = 1, R = Fmoc 21b П = 1, R = Z 24 n = 2, R = Z.

27a R1 = Fmoc, Rz = Ptht, R3 = Bz.

27b R1 = Z, R2 = Ptht, R3 = Bz.

28 R1 = H, R2 = Ptht, R3=Bz.

29 R1 = H, R2 = H2, R3=H.

Схема 5. а: для X = Вг: Н§ Вг2, Н§(СМ)2, СНзСЫдля X — БЕК N18, ТЮН, СН2С12 МЭ 4А Таблица 1. Результаты реакций терминированной олигомеризации.

Мономер Терминатор Продукты реакции.

1 20* 7а 10 (30%), 29 п=1 (10%).

2 20* 21а 10 (30%), 29 п=2(12%).

3 20** 21а 10 (25%), 29 п-2 (15%), 29 п=4.

4 20** 21Ь 10 (25%), 29 п=2 (12%), 29 п=4.

5 20** 24 10 (25%), 29 (14%).

6 25** 24 30 (95%).

7 26** 24 30 (50%) Единовременное добавление мономера. **Мономер был добавлен пятью равными порциями.

Однако в ходе олигомеризации соединения 20.

ВгООВг терминатора 21а были выделены из реакционной смеси в неизменном виде. С целью увеличения конверсии составил 12%. При этом 50% введенного в реакцию.