Структурно-функциональная организация ионтранспортирующих мембранных белков

Фундаментальным свойством живой клетки является наличие градиента концентраций различных ионов относительно как наружной мембраны, так и мембран внутриклеточных компартаментов. Зависимыми от внутриклеточной концентрации ионов являются такие физиологически важные процессы как возбудимость и сократимость клеток, все виды клеточного движения, секреция гормонов и пищеварительных ферментов, высвобождение нейромедиаторов и транспорт метаболитов. Среди всего многообразия ионов, участвующих в метаболизме целой клетки и ее органелл, ключевую роль играют ионы водорода, калия, натрия и кальция. Нарушение внутриклеточного баланса именно этих катионов вызывает необратимые метаболические сдвиги, губительные для клетки, а на уровне организма в целом является одной из причин возникновения и развития многих тяжелых заболеваний.

В клеточных мембранах существует большое многообразие систем транспорта ионов, важнейшую роль среди которых играют мембранные системы активного транспорта катионов — ионзависимые АТФазы. Одни из них отвечают за поддержание градиента концентрации ионов, другие используют созданный градиент как движущую силу для катализа тех или иных биохимических реакций. В свою очередь различные ионы, участвующие в клеточном гомеостазе, требуют наличия широкого спектра систем транспорта этих ионов через мембраны клеток и их органелл.

Большая физиологическая значимость транспорта ионов предопределяет интенсивность исследований самых различных структурно-функциональных аспектов всего многообразия ионтранспортирующих систем. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в мире за последние годы в этой области, исследование трехмерной и надмолекулярной структуры ионтранспортирующих систем до сих пор находится на начальном этапе своего развития, поскольку специфические трудности работы со сложноорганизованными мембранными белками не позволяют эффективно использовать метод рентгеноструктурного анализа. Это обстоятельство сдерживает прогресс в изучении реальных механизмов функционирования систем активного транспорта катионов через биологические мембраны.

В то же время список существующих ионтранспортирующих систем на сегодняшний день далеко не полон, и даже грандиозное продвижение в секвенировании генома человека не дает оснований полагать, что в ближайшее время будут полностью определены первичные структуры всех мембранных белков, поскольку структурное многообразие часто увеличивается за счет альтернативного сплайсинга.

Исходя из вышеизложенного, необходимо отметить, что изучение связи между химической структурой, пространственной организацией и принципами функционирования мембранных белковых комплексов, а также поиск новых элементов систем ионного транспорта, необходимых для жизнедеятельности организмов, является одной из основных проблем современной физико-химической биологии.

Основной целью настоящей работы явилась характеризация структуры разных уровней нескольких мембранных ионтранспортирующих белков, а именно Са2±АТФазы плазматических мембран, изоформ Х+, К±АТФаз и Н±трансгидрогеназы.

Наиболее распространенными в животном мире системами активного транспорта ионов являются катионтранспортирующие АТФазы (Н±, Си Na*,^-АТФазы и Са2±АТФаза плазматических мембран). Используя энергию гидролиза АТФ, эти сложные биологические машины осуществляют два взаимосвязанных и противоположно направленных процесса: выброс ионов водорода или натрия и одновременный перенос ионов калия в клетку в случае Х+, К±АТФаз и выведение ионов кальция в случае Са2±АТФазы. Таким образом, происходит тонкая регуляция ионного состава и объема клетки и обеспечивается постоянство неравновесного распределения катионов между клеткой и средой.

Одним из потребителей протонного градиента относительно внутренней митохондриальной мембраны, а также клеточной мембраны бактерий является Н±транспортирующая никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназа (Н+трансгидрогеназа), использующая перенос протона для смещения равновесия NADP+NADH -> NADPH + NAD. Физиологическая роль данной реакции до сих пор не осознана полностью, однако о ее важности говорит значительная консервативность структуры Н± трансгидрогеназы бактерий и животных.

В исследование структуры входит прежде всего определение аминокислотной последовательности фермента, установление субъединичного состава, идентификация участков, ответственных за каталитические и регуляторные свойства, а затем определение его трехмерной структуры.

В связи с естественными сложностями установления трехмерной структуры мембранных белков в данной работе основной акцент был сделан на использование иммунохимических методов, связанных с получением специфических монои поликлональных антител к указанным системам. Антитела позволяют в первую очередь зондировать пространственную организацию фермента, прежде всего трансмембранную укладку полипептидной цепи, а изучение влияния антител на каталитические свойства фермента дает возможность определять функционально важные участки молекулы белка. Решение этих задач требует как тонкого картирования эпитопов, так и получения антител с предопределенной специфичностью.

Другим аспектом применения антител является выделение изучаемого белка методом иммуноаффинной хроматографии с целью изучения субъединичного строения той или иной системы, т. е. получения информации о четвертичной структуре. Данный подход особенно ценен в изучении белков, синтезируемых клетками в малых количествах. Детекция изучаемого фермента в органах и тканях при помощи антител позволяет создать основу для выяснения конкретной физиологической роли той или иной системы на уровне целого организма.

Учитывая данные по изучению ионтранспортирующих систем, полученные другими исследователями, основное внимание было направлено на получение коллекций моноклональных антител (МА) к вышеупомянутым объектам и характеризацию специфичности (локализацию эпитопов) полученных антител, а также применение данных антител для тестирования трансмембранной организации Са2+" АТФазы плазматических мембран и Ма+, К±АТФазы. Получение же ингибирующего МА к Н±трансгидрогеназе и тонкое картирование его эпитопа позволило создать модель расположения доменов Н±трансгидрогеназы Е. со//.

В исследовании ранее малоизученной Н+, К±АТФазы нежелудочного типа (продукт гена ATP1AL1J усилия были сфокусированы на изучении тканеспецифичной экспрессии и иммуногистохимической локализации в тканях с максимальным уровнем экспрессии гена.

Кроме того, проводили поиск новых изоформ субъединиц ионтранспортирующих ферментов на уровне транскриптов. При этом была определена первичная структура новой р-субъединицы ХК±АТФаз, присутствующей только в мышечной ткани (поэтому названной рт). В сравнении с другими членами семейства р-субъединиц Х+, К±АТФаз гипотетический белок рт имеет необычные структурные черты, такие как наличие N-концевого домена, богатого остатками Glu, а также необычный тип гликозилирования своего эктодомена.

Показано, что белковые продукты генов млекопитающих, гомологичные ATP1AL1 человека, следует рассматривать как одну изоформу Н+, К±АТФазы нежелудочного типа. Данные гены имеют высокий уровень экспрессии в прямой кишке млекопитающих (за исключением человека), коже и некоторых урогенитальных органах (особенно в коагулирующей железе крысы). Более подробный анализ указывает на то, что данная АТФаза специфична для апикальных мембран эпителия соответствующих органов.

Одной из характерных особенностей данной работы явилось широкое внедрение при решении проблем структурно-функциональных взаимоотношений библиотек экспрессированных фрагментов генов исследуемых ферментов с последующим установлением их функциональной и иммунохимической активности. Этот подход, являясь более эффективным, с успехом заменил широко распространенный ранее метод пептидного картирования.

Тщательно охарактеризованные моноклональные антитела — исключительно полезный инструмент в исследованиях биополимеров. Антитела, специфичные к определенным изоформам ферментов, находят широкое применение, например, для иммунохимической детекции соответствующих изоформ в тканях организма. Например, в данной работе показано, что одно из МА реагирует только с 4-й изоформой Са-АТФазы плазматических мембран (hPMCA4), а другое — распознает все известные изоформы Са2±АТФазы высших животных. Это позволяет определять содержание hPMCA4 относительно общего пула фермента.

При помощи анализа связывания охарактеризованных МА с интактными эритроцитами и мембранными пузырьками получено подтверждение теоретической модели трансмембранной укладки N-концевой половины молекулы Са2+" АТФазы плазматических мембран и С-концевой половины а-субъединицы ЫаМГ-АТФазы.

Кроме того, показана практическая возможность использования С-концевого домена Са2±АТФазы для продукции, детекции и аффинной очистки рекомбинантных белков, что с успехом применено для получения высокоочищенной Н±трансгидрогеназы Е. coli. Несмотря на то, что к настоящему времени уже предложено немало различных «партнеров» для создания гибридных белков, например, гексагистидиновая последовательность (которая также широко применялась в данной работе), использование аффинной хроматографии на кальмодулине имеет определенные преимущества, например, позволяет проводить выделение химерных белков в строгих восстановительных условиях.

Таким образом, открыто как существование новых компонентов систем транспорта ионов (рм), так и получена обширная информация по различным аспектам структуры и функции хорошо известных и важных систем. Вся полученная информация существенно расширяет возможности дальнейших исследований функционирования систем транспорта ионов через биологические мембраны.

выводы.

1. Осуществлено комплексное исследование разных уровней структуры и функции ряда ионтранспортирующих мембранных белков: Са2±АТФазы плазматических мембран, Н±транспортирующей трансгидрогеназы, а также изоформ аи р-субъединиц Х+, К±АТФаз. Показано, что универсальным инструментом в исследованиях таких сложноорганизованных мембранных систем являются моноклональные и специфические поликлональные антитела. Применения антител включают в себя тестирование трансмембранной топологии ферментов и зондирование междоменных взаимодействий при помощи ингибирующих антител. Специфические антитела незаменимы для тонкого изучения тканеспецифичной экспрессии, в особенности для характеризации новых изоформ.

2. Получена коллекция МА к Са2+" АТФазе плазматических мембран, выделенной из эритроцитов человека. При помощи иммуноферментного анализа протеолитических и рекомбинантных фрагментов Са2+" АТФазы плазматических мембран и скрининга больших библиотек случайных гексаи пентадекапептидов методом фагового дисплея картированы эпитопы пяти моноклональных антител к Са2±АТФазе (МА). Эпитоп МА 2D8 локализован в районе 222−249 (в предполагаемом домене трансдукции), эпитопы МА 8В8 и 7С8 — в районе 330−353 (в сайте связывания кислых фосфолипидов), МА 5Е6 — в районе 791−843 (в предполагаемом шарнирном регионе), МА 1Е4 — в районе 130−142 (первая внеклеточная петля). МА 2D8 распознает РМСА1 и РМСА4, в то время как 1Е4, 8В8 и 7С8 специфичны к hPMCA4.

3. При помощи анализа связывания характеризованных МА с интактными эритроцитами и мембранными пузырьками получено подтверждение теоретической модели трансмембранной укладки N-концевой половины молекулы Са2+" АТФазы плазматических мембран.

4. Разработан новый способ очистки химерной Н±трансгидрогеназы Е. coli с использованием аффинной хроматографии на иммобилизованном кальмодулине.

5. С использованием очищенной химерной Н±трансгидрогеназы Е. coli для иммунизации получена коллекция МА к данному ферменту. Показано, что эпитопы трех МА имеют интегральную природу и состоят из участков, принадлежащих как а-, так и р-субъединице Н±трансгидрогеназы. Одно МА (2G10) специфически распознает домен la а-субъединицы. Более точное картирование эпитопа показало, что МА связывается с участками 5−15 и 65−79, причем остаток Arg9 абсолютно необходим для связывания.

6. МА 2G10 эффективно ингибирует Н±трансгидрогеназу Е. coli, но не влияет на способность связывать субстраты. На основании данных по картированию эпитопа этого МА предположено, что ингибирование происходит благодаря блокированию междоменных взаимодействий, необходимых для трансгидрогенизации, а также предложена модель расположения доменов Н±трансгидрогеназы Е. coli относительно мембраны и друг друга.

7. Показано, что белковые продукты генов млекопитающих, гомологичные гену ATP1AL1 человека, следует рассматривать как одну изоформу Н+, К±АТФазы нежелудочного типа. Данные гены имеют высокий уровень экспрессии в прямой кишке млекопитающих (за исключением человека), коже и некоторых урогенитальных органах (особенно в коагулирующей железе крысы). Более подробный анализ указывает на то, что данная АТФаза специфична для апикальных мембран эпителия соответствующих органов.

8. С применением полии моноклональных антител, специфичных к участкам каталитической а-субъединицы МаК±АТФазы, показано внутриклеточное расположение участков 541−589, 825−842 и 928−945. Участки 868−886, 946−967 и 962−978 не имеют экспонированных наружу эпитопов, что может свидетельствовать об их расположении или внутри мембраны, или внутри массивной внутриклеточной глобулы фермента. Полученные данные подтверждают теоретическую модель трансмембранной укладки С-концевой половины а-субъединицы Ма+, К±АТФазы, предполагающих существование 6 трансмембранных столбов в этом участке.

9. Определена первичная структура новой р-субъединицы ХК±АТФаз, присутствующая только в мышечной ткани (поэтому названная рт). В сравнении с другими членами семейства р-субъединиц Х+, К±АТФаз гипотетический белок рт имеет необычные структурные черты, такие как наличие N-концевого домена, богатого остатками глутаминовой кислоты, а также необычный тип гликозилирования своего эктодомена.

Благодарности.

Осуществлению намеченных планов и завершению работы над диссертацией во многом способствовали плодотворные дискуссии с академиками РАН Вадимом Тихоновичем Ивановым и Анатолием Ивановичем Мирошниковым, а также с профессором Цетлиным Виктором Ионовичем, за что автор им искренне признателен.

Автор считает своим приятным долгом поблагодарить коллег и друзей, совместно с которыми были получены экспериментальные результаты, составившие основу данной работы: Нину Александровну Алданову, Марьяну Юрьевну Фейгину, Марию Борисовну Костину, Николая Борисовича Пестова, Татьяну Васильевну Корнеенко, Николая Николаевича Модянова, Николая Сергеевича Быстрова.

Работа выполнялась при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, Министерства науки и технологий, Международного научного фонда, Шведского совета по естественным наукам, Американского фонда гражданских исследований и ИНТАС.