Методы изучения цитокинов

В комплексный анализ системы цитокинов входит следующее.

I. Оценка клеток-продуцентов.

• 1. Определение экспрессии:
  • · рецепторов, распознающих патоген или антиген TКР, TLR) на уровне генов и молекулы белка (ПЦР, метод проточной цитофлуориметрии);
  • · адаптерных молекул, проводящих сигнал, запускающий транскрипцию цитокиновых генов (ПЦР и др.);
  • · генов цитокинов (ПЦР); белковых молекул цитокинов (оценка цитокинсинтезирующей функции мононуклеарных клеток человека).
• 2. Количественное определение субпопуляций клеток, содержащих те или иные цитокины: Th1, Th2 Th17 (метод внутриклеточного окрашивания цитокинов); определение количества клеток, секретирующих определенные цитокины (метод ELISPOT).

II. Оценка цитокинов и их антагонистов в биологических средах организма.

• 1. Tестирование биологической активности цитокинов.
• 2. Количественное определение цитокинов с помощью ИФА.
• 3. Иммуногистохимическое окрашивание цитокинов в тканях.
• 4. Определение соотношения оппозитных цитокинов (прои противовоспалительных), цитокинов и антагонистов рецепторов цитокинов.

III. Оценка клеток-мишеней.

• 1. Определение экспрессии рецепторов цитокинов на уровне генов и белковой молекулы (ПЦР, метод проточной цитофлуориметрии).
• 2. Определение сигнальных молекул во внутриклеточном содержимом.
• 3. Определение функциональной активности клеток-мишеней.

В настоящее время разработаны многочисленные методы оценки системы цитокинов, которые дают разноплановую информацию. Среди них различают:

• 1) молекулярно-биологические методы;
• 2) методы количественного определения цитокинов с помощью иммуноанализа;
• 3) тестирование биологической активности цитокинов;
• 4) внутриклеточное окрашивание цитокинов;
• 5) метод ELISPOT, позволяющий выявить цитокины вокруг единичной цитокинпродуцирующей клетки;
• 6) иммунофлюоресценцию.

Краткая характеристика этих методов:

С помощью молекулярно-биологических методов можно исследовать экспрессию генов цитокинов, их рецепторов, сигнальных молекул, изучать полиморфизм указанных генов. В последние годы выполнено большое число работ, выявивших ассоциации между вариантами аллелей генов молекул системы цитокинов и предрасположенностью к ряду заболеваний. Изучение аллельных вариантов генов цитокинов может дать информацию о генетически запрограммированной продукции того или иного цитокина. Наиболее чувствительной считается полимеразная цепная реакция в реальном времени — ПЦР-РВ. Метод гибридизации in situ позволяет уточнить тканевую и клеточную локализацию экспрессиии цитокиновых генов.

Количественное определение цитокинов в биологических жидкостях и в культурах мононуклеарных клеток периферической крови методом ИФА можно охарактеризовать следующим образом. Поскольку цитокины являются локальными медиаторами, более целесообразно измерять их уровни в соответствующих тканях после экстракции тканевых протеинов или в естественных жидкостях, например, в слезе, смывах из полостей, моче, амниотической жидкости, спинномозговой жидкости и т. д. Уровни цитокинов в сыворотке или других биологических жидкостях отражают текущее состояние иммунной системы, т. е. синтез цитокинов клетками организма in vivo.

Определение уровней продукции цитокинов мононуклеарами периферической крови (МНК) показывает функциональное состояние клеток. Спонтанная продукция цитокинов МНК в культуре свидетельствует, что клетки уже активированы in vivo. Индуцированный (различными стимуляторами, митогенами) синтез цитокинов отражает потенциальную, резервную способность клеток отвечать на антигенный стимул (в частности, на действие лекарственных препаратов). Сниженная индуцированная продукция цитокинов может служить одним из признаков иммунодефицитного состояния. Цитокины не специфичны в отношении конкретного антигена. Поэтому специфическая диагностика инфекционных, аутоиммунных и аллергических заболеваний с помощью определения уровня тех или иных цитокинов невозможна. В то же время оценка уровней цитокинов позволяет получить данные о тяжести воспалительного процесса, его переходе на системный уровень и прогнозе, функциональной активности клеток иммунной системы, о соотношении Th1- и Th2-клеток, что очень важно при дифференциальной диагностике ряда инфекционных и иммунопатологических процессов.

В биологических средах можно определить цитокины количественно с помощью целого ряда методов иммуноанализа, используя поликлональные и моноклональные антитела. ИФА позволяет узнать, каковы точные концентрации цитокинов в биологических жидкостях организма. Иммуноферментное выявление цитокинов имеет ряд преимуществ перед другими методами (высокая чувствительность, специфичность, независимость от присутствия антагонистов, возможность точного автоматизированного учета, стандартизации учета). Однако и этот метод имеет свои ограничения: ИФА не характеризует биологическую активность цитокинов, может давать ложные результаты за счет перекрестно-реагирующих эпитопов.

Биологическое тестирование проводят на основе знания основных свойств цитокинов, их действия на клетки-мишени. Изучение биологических эффектов цитокинов позволило разработать четыре разновидности тестирования цитокинов:

• 1) по индукции пролиферации клеток-мишеней;
• 2) по цитотоксическому эффекту;
• 3) по индукции дифференцировки костномозговых предшественников;
• 4) по противовирусному действию.

ИЛ-1 определяют по стимулирующему действию на пролиферацию мышиных тимоцитов, активированных митогеном in vitro; ИЛ-2 — по способности стимулировать пролиферативную активность лимфобластов; по цитотоксическому действию на мышиные фибробласты (L929) тестируют ФНОа и лимфотоксины. Колониестимулирующие факторы оценивают по их способности поддерживать рост костномозговых предшественников в виде колоний в агаре. Противовирусную активность ИФН выявляют по угнетению цитопатического действия вирусов в культуре диплоидных фибробластов человека и опухолевой линии фибробластов мышей L-929.

Созданы клеточные линии, рост которых зависит от присутствия определенных цитокинов. В таблице представлен список клеточных линий, используемых для тестирования цитокинов.

Таблица. Клеточные линии, используемые для тестирования биологической активности цитокинов.

По способности индуцировать пролиферацию чувствительных клеток-мишеней проводят биотестирование ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-15 и др. Однако эти методы тестирования отличаются недостаточной чувствительностью и информативностью. Молекулы ингибиторов и антагонистов могут маскировать биологическую активность цитокинов. Некоторые цитокины проявляют общую биологическую активность. Тем не менее эти методы идеальны для тестирования специфической активности рекомбинантных цитокинов.

Определение биологической активности ИЛ-1 по комитогенному действию на пролиферацию тимоцитов мышей В основе метода биологического тестирования ИЛ-1 лежит способность цитокина стимулировать пролиферацию мышиных тимоцитов.

ИЛ-1 может быть определен в культуре моноцитов, стимулированных ЛПС, а также в любой биологической жидкости организма. Необходимо обратить внимание на ряд деталей.

• 1. Для тестирования применяют тимоциты мышей линии С3Н/ HeJ, стимулированные к пролиферации митогенами (конканавалин, А — КонА и фитогемагглютинин — ФГА). Тимоциты С3Н/HeJ выбраны не случайно: мыши этой инбредной линии не отвечают на ЛПС, который может находиться в составе тестируемого материала и вызывать продукцию ИЛ-1.
• 2. Тимоциты отвечают на ИЛ-2 и митогены, поэтому в препаратах, тестируемых на ИЛ-1, следует определять также присутствие ИЛ-2 и митогенов.

Порядок работы.

• 1. Получают суспензию тимоцитов в концентрации 12Ч106/мл среды RРМI 1640, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров и 2-меркаптоэтанол (5Ч10−5 М).
• 2. Готовят ряд последовательных двукратных разведений опытных (биологические жидкости организма) и контрольных образцов. В качестве контрольных используют биологические жидкости, содержащие ИЛ-1 или образцы, полученные при инкубации мононуклеарных клеток без ЛПС, и лабораторный стандартный ИЛ-1-содержащий препарат. В 96-луночные круглодонные планшеты из каждого разведения переносят по 50 мкл в 6 лунок.
• 3. В три лунки каждого разведения добавляют по 50 мкл растворенного в полной среде очищенного ФГА (Wellcome) в концентрации 3 мкг/мл, а в другие 3 лунки — по 50 мкл среды.
• 4. В каждую лунку добавляют по 50 мкл суспензии тимоцитов и инкубируют в течение 48 ч при 37 °C.
• 5. Перед завершением культивирования в лунки вносят по 50 мкл раствора (1 мкКи/мл) ['3Н]-тимидина и инкубируют еще 20 ч.
• 6. Для определения уровня радиоактивности клетки культуры переносят на фильтровальную бумагу с помощью автоматического сборщика клеток, фильтры высушивают и определяют включение метки жидкостным сцинтилляционным счетчиком.
• 7. Результаты выражают в виде коэффициента стимуляции.

где mср — среднее число импульсов в 3 лунках.

Если тимоциты отвечают на стимуляцию стандартным ИЛ-1, то индекс стимуляции исследуемого образца, превышающий 3, достоверно свидетельствует об ИЛ-1-активности.

Биоанализ является единственным методом для оценки функционирования цитокина, но данный метод должен быть дополнен разными видами соответствующего контроля на специфичность с использованием моноклональных антител. Добавление определенных моноклональных антител к цитокину в культуру блокирует биологическую активность цитокина, что доказывает: сигналом к пролиферации клеточной линии служит определяемый цитокин.

Использование биоанализа для выявления интерферона. Принцип оценки биологической активности ИФН основан на его противовирусном действии, которое определяется по степени ингибиции размножения тест-вируса в культуре клеток. В работе могут быть использованы клетки, чувствительные к действию ИФН: первично трипсинизированные клетки-фибробласты эмбрионов кур и человека, перевиваемые клетки диплоидных фибробластов человека и культура мышиных клеток (L929).

При оценке противовирусного действия ИФН целесообразно использовать вирусы с коротким циклом размножения, высокой чувствительностью к действию ИФН: вирус энцефаломиелита мышей, везикулярного стоматита мыши и др.

Определение активности интерферона.

• 1. Взвесь диплоидных фибробластов плода человека на среде с 10% сывороткой эмбрионов коров (концентрация клеток — 15−20Ч106/мл) разливают в стерильные 96-луночные плоскодонные планшеты по 100 мкл в лунку и помещают в СО2-инкубатор при температуре 37 °C.
• 2. После формирования полного монослоя из лунок удаляют ростовую среду и в каждую лунку добавляют по 100 мкл поддерживающей среды.
• 3. Титрование активности ИФН в исследуемых образцах проводят методом двукратных разведений на монослое фибробластов.

Одновременно с образцами в лунки вносят вирус энцефаломиелита мышей (ВЭМ) в дозе, вызывающей 100% поражение клеток через 48 ч после заражения.

4. Для контроля используют лунки с интактными (необработанными) клетками, зараженными вирусом.

В каждом исследовании в качестве референс-препаратов используют пробы референс-ИФН с известной активностью.

• 5. Планшеты с разведениями образца инкубируют 24 ч при температуре 37 °C в атмосфере с 5% содержанием СО2.
• 6. Уровень активности ИФН определяют величиной, обратной значению максимального разведения тестируемого образца, задерживающего цитопатическое действие вируса на 50%, и выражают ее в единицах активности на 1 мл.
• 7. Для определения типа ИФН в систему добавляют антисыворотку против ИФНб, ИФНв или ИФНг. Антисыворотка отменяет действие соответствующего цитокина, что позволяет идентифицировать тип ИФН.

Определение биологической активности миграции ингибирующего фактора (МИФ). В настоящее время сформировались совершенно новые представления о природе и свойствах МИФ, открытого в 60-х годах прошлого столетия в качестве медиатора клеточного иммунитета и много лет остававшегося без должного внимания. Лишь в последние 10−15 лет стало ясно: МИФ представляет собой один из важнейших биологических медиаторов в организме с широким спектром биологических функций цитокина, гормона, фермента. Действие МИФ на клетки-мишени реализуется через СD74—рецептор или через неклассический путь эндоцитоза.

МИФ рассматривают как важный медиатор воспаления, активирующий функцию макрофагов (выработку цитокинов, фагоцитоз, цитотоксичность и др.), а также как эндогенный иммунорегуляторный гормон, модулирующий глюкокортикоидную активность.

Накапливается все больше сведений о роли МИФ в патогенезе многих воспалительных заболеваний, включая сепсис, ревматоидный артрит (РА), гломерулонефрит и др. При РА значительно увеличена концентрация МИФ в жидкости пораженных суставов, коррелирующая с тяжестью заболевания. Под влиянием МИФ возрастает выработка провоспалительных цитокинов как макрофагами, так и синовиальными клетками.

Известны различные методы тестирования активности МИФ, когда мигрирующие клетки (клетки-мишени для МИФ) помещают в стеклянный капилляр (капиллярный тест), в каплю агарозы или в агарозный колодец.

Это сравнительно простой скрининговый метод, основанный на формировании на дне лунок 96-луночного плоскодонного планшета клеточных микрокультур (лейкоцитов или макрофагов), стандартных по площади и числу клеток, с последующим их культивированием в питательной среде и определением изменения площади этих микрокультур при действии МИФ.

Определение МИФ-активности Определение биологической активности МИФ проводят с помощью устройства для формирования клеточных микрокультур — МИГРОСКРИН (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН).

• 1. В лунки 96-луночного планшета (Flow, Великобритания или аналогичные) добавляют по 100 мкл разведенной на культуральной среде пробы, в которой определяют МИФ-активность (каждое разведение в 4 параллелях, опытные пробы). Культуральная среда включает RPMI 1640, 2 mM L-глутамина, 5% сыворотки эмбриона коровы, 40 мкг/мл гентамицина.
• 2. В контрольные лунки добавляют культуральную среду (в 4 параллелях) по 100 мкл.
• 3. Готовят клеточную суспензию перитонеальных макрофагов, для чего 2 мышам-гибридам (СВАхС57В1/6) F1 внутрибрюшинно вводят по 10 мл раствора Хенкса с гепарином (10 ЕД/мл), осторожно массируют брюшко в течение 2−3 мин. Затем животное забивают декапитацией, осторожно прокалывают брюшную стенку в области паха и через иглу шприцем отсасывают экссудат. Клетки перитонеального экссудата дважды отмывают раствором Хенкса, центрифугируя их 10−15 мин при 200 g. Затем готовят суспензию клеток с концентрацией 10±1 млн/мл среды RPMI 1640. Подсчет проводят в камере Горяева.
• 4. Собирают систему МИГРОСКРИН, представляющую собой штатив для направленной и стандартной фиксации наконечников с клеточными культурами в строго вертикальном положении на заданной высоте над центром лунки 96-луночного культурального планшета, а также включающую 92 наконечника для автоматической пипетки фирмы «Costar», USA.

1. Схема МИГРОСКРИН — устройства для количественной оценки миграции клеточных культур Вставляют ножки штатива в угловые лунки планшета. Клеточную суспензию набирают автоматической пипеткой в наконечники — по 5 мкл в каждый, ополаскивают от избытка клеток однократным опусканием в среду и вставляют вертикально в гнезда штатива системы. Заполненный штатив с наконечниками выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч на строго горизонтальной поверхности. За это время происходит оседание клеток суспензии на дно лунок, где формируются стандартные клеточные микрокультуры.

• 5. Штатив с наконечниками осторожно снимают с планшета. Планшет с микрокультурой клеток помещают в строго горизонтальном положении в СО2-инкубатор, где культивируют в течение 20 ч. В ходе культивирования клетки мигрируют по дну лунки.
• 6. Количественный учет результатов после инкубации проводят на бинокулярной лупе, визуально оценивая размер колонии по шкале внутри окуляра. Микрокультуры имеют форму круга. Затем исследователи определяют среднее значение диаметра колоний по результатам измерения колоний в 4 опытных или контрольных лунках. Погрешность измерения равна ±1 мм.

Индекс миграции (ИМ) рассчитывают по формуле:

Проба обладает МИФ-активностью, если значения ИМ равны 0,6±0,2.

За условную единицу (ЕД) МИФ-активности принимают обратную величину, равную значению наибольшего разведения пробы (образца), при котором индекс миграции равен 0,6±0,2.

Биологическую активность ФЕOб оценивают по цитотоксическому его действию на линию трансформированных фибробластов L-929. В качестве положительного контроля используют рекомбинантный ФНОа, а в качестве отрицательного контроля — клетки в культуральной среде.

Вычисляют цитотоксический индекс (ЦИ):

где a — количество живых клеток в контроле; b — количество живых клеток в опыте.

Клетки окрашивают красителем (метиленовым синим), который включается только в погибшие клетки.

За условную единицу активности ФНО принимают значение обратного разведения образца, необходимого для получения 50% клеточной цитотоксичности. Удельная активность образца — отношение активности в условных единицах на 1 мл к концентрации белка, содержащегося в образце.

Внутриклеточное окрашивание цитокинов. Изменение соотношения клеток, продуцирующих различные цитокины, может отражать патогенез заболевания и служить критерием прогноза заболевания и оценки проводимой терапии.

Методом внутриклеточного окрашивания определяют экспрессию цитокина на уровне одной клетки. Проточная цитофлуориметрия позволяет подсчитать количество клеток, экспрессирующих тот или иной цитокин.

Нестимулированные клетки продуцируют небольшие количества цитокинов, которые, как правило, не депонируются, поэтому важным этапом оценки внутриклеточных цитокинов являются стимуляция лимфоцитов и блокада выхода этих продуктов из клеток.

В качестве индуктора цитокинов чаще всего используют активатор протеинкиназы С форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА) в комбинации с ионофором кальция иономицином (ИН). Применение такого сочетания вызывает синтез широкого спектра цитокинов: ИФНу, ИЛ-4, ИЛ-2, ФНОб. Недостаток использования ФМА-ИН — проблемы выявления CD4-молекул на поверхности лимфоцитов после такой активации. Также продукцию цитокинов Т-лимфоцитами индуцируют с помощью митогенов (ФГА). В-клетки и моноциты стимулируют ЛПС.

Мононуклеарные клетки инкубируют в присутствии индукторов продукции цитокинов и блокатора их внутриклеточного транспорта брефельдина, А или моненсина в течение 2−6 ч.

Основные этапы определения внутриклеточных цитокинов:

Затем клетки ресуспендируют в буферном растворе. Для фиксации добавляют 2% формальдегид, инкубируют 10−15 мин при комнатной температуре.

Потом клетки обрабатывают сапонином, который повышает проницаемость клеточной мембраны, и окрашивают моноклональными антителами, специфичными к определяемым цитокинам. Предварительное окрашивание поверхностных маркеров (CD4, CD8) увеличивает количество получаемой информации о клетке и позволяет более точно определить ее популяционную принадлежность.

Имеются некоторые ограничения в применении описанных выше методов. Так, с их помощью невозможно анализировать синтез цитокинов единичной клеткой, невозможно определить количество цитокинпродуцирующих клеток в субпопуляции, невозможно определить, экспрессируют ли цитокинпродуцирующие клетки уникальные маркеры, синтезируются ли различные цитокины разными клетками или одними и теми же. Ответ на эти вопросы получают, используя другие методы исследования. Для определения частоты цитокин-продуцирующих клеток в популяции применяют метод лимитирующих разведений и вариант иммуноферментного анализа ELISPOT.

Метод гибридизации in situ. Метод включает:

• 1) замораживание органа и приготовление криостатных срезов;
• 2) фиксацию параформальдегидом;
• 3) выявление мРНК с помощью меченой кДНК. В некоторых случаях цитокиновую мРНК определяют на срезах с помощью радиоизотопной ПЦР.

Иммунофлюоресценция. Метод включает:

• 1) замораживание органа и приготовление криостатных срезов;
• 2) фиксацию;
• 3) обработку срезов меченными флюоресцеином антицитокиновыми антителами;
• 4) визуальное наблюдение флюоресценции.

Эти методики (гибридизация in situ и иммунофлюоресценция) быстры и не зависят от пороговых концентраций секретируемого продукта. Однако они не определяют количество секретированного цитокина и могут быть сложны технически. Необходим разнообразный тщательный контроль на неспецифические реакции.