Вопрос 4. Биологический метод определения пирогенности воды для инъекций и инъекционных растворов, достоинства и недостатки

Вода в фармацевтическом производстве относится к ключевым элементам, обеспечивающим безопасность изготавливаемых лекарственных средств. Без применения воды самого разного качества не обходится практически ни одно фармацевтическое предприятие. Она может использоваться как сырье, вспомогательный материал, а так же как энергоноситель. В технологическом процессе изготовления лекарственных средств, особенно для парентерального применения, вода занимает одно из первых мест среди основных источников пирогенных веществ, химического, микробиологического загрязнения, поэтому важной задачей является обеспечение высокого качества воды для фармацевтических целей, что достигается оптимальным выбором системы водоподготовки [4].

При производстве лекарственных средств для парентерального применения необходимо использовать воду для инъекций, к которой предъявляются достаточно жесткие требования. Одно из них — отсутствие пирогенных веществ. Получить апирогенный продукт, а, это — одно из основных требований, предъявляемым к инъекционным препаратам, можно лишь при правильной организации всего технологического процесса получения лекарства, в частности, контроля на содержание пирогенов. Наиболее рациональные точки контроля при изготовлении парентеральных лекарственных средств следующие: контроль сырья, контроль воды для инъекций, проверка элементов фильтра на вымывание из них пирогенов, контроль растворов перед стерилизующим фильтрованием, контроль чистоты ампул, флаконов. Основными источниками пирогенных веществ в воде для инъекций являются системы умягчения воды, деионизации и угольный фильтр, которые требуют наиболее пристального внимания, частой регенерации, очистке и т. п.

Требование апирогенности воды для инъекций связано с возможностью возникновения пирогенной реакции, которая выражается повышеним температуры тела, ознобом и другими симптомами. Причиной такой реакции часто являются эндотоксины граммотрицательных бактерий, которые при внутривенном введении обладают значительно большей активностью, чем при подкожном или внутримышечном введении. В связи с этим особенно опасны инфузионные растворы, загрязненные бактериальными эндотоксинами, т.к. они вводятся человеку в больших объемах.

Согласно ГФ XI тест на пирогенность проводится биологическим методом на кроликах, основанным на измерение температуры тела животных после внутривенного введения испытуемого препарата. Использование млекопитающих, вида, близкого к человеку, позволяет установить влияние испытуемого препарата на целый организм.

С помощью испытания на животных возможно определять действие обоих классов пирогенов — «экзо» и «эндо» — токсинов, а также пирогенов небактериальной природы. Однако этот метод достаточно длителен (4−5 часов), дает значительную вариабельность результатов, связанную с индивидуальной чувствительностью (чувствительность животных в 3−4 раза ниже, чем у человека), сезонностью. Используемые в эксперименте животные, должны содержаться в строго определенных условиях. Кроме того, многие лекарственные вещества в дозах, близких к терапевтическим, могут вызвать токсические реакции и даже гибель животных.

Наряду с фармакопейным методом возможно использование люминесцентного метода, основанного на способности бактериальных эндотоксинов усиливать флуоресценцию родамина 6Ж и 1-анилина-нафталин-8-сульфоната; флуориметрического метода, основанного на измерении собственной интегральной флуоресценции бактериальных пирогенов в пределах длин волн эмиссии от 310 до 400 нм. [3].

В настоящее время доминирующее значение для контроля за содержанием пирогенных примесей, а именно, бактериальных эндотоксинов (БЭ), получил LALтест, позволяющий проводить испытания in vitro .

В основе метода лежит способность лизата амебоцитов (клеток крови) мечехвоста Limulus polyphemus специфически реагировать с эндотоксинами грамотрицательных бактерий — липополисахаридами. При взаимодействии эндотоксина и лизата происходит помутнение прозрачной реакционной смеси или образование твердого геля (тромбообразование), что и служит индикатором присутствия эндотоксина в реакционной смеси. Тест высокоспецифичен по отношению к эндотоксинам грамотрицательных бактерий. Чувствительность его во много раз превышает чувствительность фармакопейного теста на кроликах. ЛАЛ-тест имеет широкий спектр применения: контроль качества воды, парентеральных лекарственных средств, инъекционных и инфузионных растворов и медицинских изделий, в которых определение уровня бактериальных эндотоксинов предписано действующими нормативными документами, для оценки качества валидации в фармацевтической промышленности. Этот тест может быть использован и для оценки санитарного состояния питьевой воды и косвенного определения содержания в ней бактерий. К настоящему времени ЛАЛ-тест прочно внедрен в практику производства и контроля лекарственных средств на ведущих фармацевтических фирмах мира. Несмотря на высокую чувствительность ЛАЛ-теста, он, тем не менее, не является экспресс-методом. Кроме того, тест также имеет некоторые ограничения. В отличие от пирогенного теста на кроликах, выявляющего пирогены широкого спектра, ЛАЛ-тест позволяет выявить только бактериальные эндотоксины — высокомолекулярные комплексы, являющиеся структурными компонентами внешней клеточной стенки грамотрицательных бактерий [5].

В связи с развитием люминесцентных методов анализа и появлением на рынке России приборов, измеряющих люминесценцию (например, Флюорат02 АВФФ-ДХ), перспективной является разработка люминесцентного экспресс-метода определения пирогенности, который удобен для использования в условиях аптеки и на различных стадиях контроля воды для инъекций. В основе метода определения пирогенности воды для инъекций лежит измерение интенсивности люминесценции в присутствии липополисахаридобелкового комплекса (примесей).