Клеточная селекция растений

Культивирование растительных клеток в культуре in vitro приводит, как правило, к накоплению генетической изменчивости. Полученные от этих клеток растения — регенеранты отличаются от исходных растений. Австралийские ученые Ларкин и Скоукрофт (1981) предложили термин «сомаклоны» для растений, прошедших стадию неорганизованного роста in vitro. Само явление возникновения новых форм растений в результате накопления генетической изменчивости в растительных клетках, культивированных in vitro, называются сомаклональной изменчивостью. Для обозначения растенийрегенерантов и их потомков приняты следующие термины:

Rрастение — регенерант; R_1, R₂ и т. д.- первое, второе и последующие самоопыленные поколения растения-регенеранта;

SC — сомаклон; SC_1, SC₂ и т. д.- первое, второе и последующие самоопыленные поколения сомаклона.

Изменчивость, проявляющуюся у растений, регенерировавших в результате культивирования протопластов, называют протоклональной изменчивостью, регенерировавшие растенияпротоклонами.

Причинами проявления сомаклональной изменчивости могут быть:

• 1. Наличие генетической изменчивости в соматической ткани, используемой в качестве экспланта для введения в культуру in vitro;
• 2. Переход растительных клеток в виде каллуса, суспензии или протопластов в недифференцированное состояние;

Длительное выращивание в культуре in vitro;

Использование специфических компонентов среды или фитогормонов.

Сомаклональная изменчивость может проявляться в следующих формах:

• 1. Цитогенетическая изменчивость (полиплоидия, анеуплодия, транслокации, делеции, инверсии, дупликации);
• 2. Генетическая изменчивость, связанная с мутациями генов ядра и цитоплазмы, транспозонами, амплификацией и редукцией генов, активацией ранее репрессированных генов, соматическим кроссинговером;
• 3. Негенетическая изменчивость (элиминация вируса, эпигенетические изменения).

На проявление сомаклональной изменчивости сильно влияют генотип, орган растения, используемый в качестве экспланта, условия культивирования и регенерации растений.

В соматических тканях растений проявляется естественное генетическое разнообразие. Установлено, что в меристемных тканях в ходе дифференцировки почти у 80% покрытосеменных на различных этапах онтогенеза может происходить эндоредупликация хромосом и формирование тканей различного уровня плоидности. Возможно также образование клеток с анеуплоидным числом хромосом. В результате образуются миксоплоиды (организмыхимеры), ткани различаются по набору хромосом в геноме. Особенно часто накопление таких соматических мутаций наблюдается у вегетативно размножаемых растений (картофель, плодовые и др.). Естественный соматический мутагенез и миксоплоидия как его результат могут быть усилены при культивировании организма в стрессовых условиях (повышенная или пониженная температура, засоление, и др.). Такие условия могут вызывать нарушения в митозе и привести к изменению числа хромосом. Таким образом, культивирование соматических миксоплоидных тканей растений является потенциальным источником генетической изменчивости и представляет интерес для селекции.

Помещение соматических клеток в культуре in vitro усиливает частоту и спектр генетической изменчивости. При этом ткань экспланта выходит из-под контроля организма, что приводит к изменению гормонального баланса. Экзогенные гормоны, содержащиеся в среде, могут вызывать нарушения клеточного цикла. В целом для ткани культивирование in vitro может рассматриваться как стресс (увеличение раневой поверхности, изменение гормонального баланса и др.), в результате которого усиливается генетическая и эпигенетическая изменчивость в клетках соматических тканей (поли — и анеуплоидия, точковые мутации, передвижение мобильных элементов, соматический кроссинговер, амплификации и др.). При генетической изменчивости образуется миксоплоид, эпигенетическая изменчивость не наследуется. Наиболее часто генетическая изменчивость в культуре in vitro наблюдается у протопластов, поскольку одиночные клетки сильнее подвержены стрессовым условиям.

Длительность культивирования in vitro также увеличивает частоту возникновения мутаций в соматических тканях. Так, например, в каллусной ткани, индуцированной из молодых зародышей диплоидного культурного ячменя (2n=14) может образоваться до 40% тетраплоидных и до 30% анеуплоидных клеток (Першина, 2000). Однако в процессе регенерации селективное преимущество получают как наиболее жизнеспособные диплоидные растения (до 99%).

Генетические изменения могут происходить не только в ядре, но и цитоплазме (митохондрии, пластиды). Так, при культивировании каллусной ткани, полученной из незрелых зародышей кукурузы с техасским типом цитоплазмы (мужскистерильной), обнаружены мужскифертильные регенеранты, причем признак наследовался по материнской линии. Анализ регенерантов на молекулярном уровне выявил наследованные изменения в митохондриальной ДНК.

Выявлены также сомаклональные мутации пластидного генома. Примером могут быть альбиносные мутации, вызванные хлорофиллдефектностью. Установлено, что причиной такого рода мутации могут быть делеции хлоропластной ДНК.

Влияние генотипа и исходного экспланта. Генотип определяет способность экспланта к каллусообразованию и регенерации, а также размах и спектр сомаклональной изменчивости. При этом на частоту сомаклональных мутаций влияют уровень плоидности, гетерозиготности, а также взаимодействие ядра и цитоплазмы. У полии амфиплоидов частота цитоплазматических мутаций выше. В связи с этим поиск генотипов с высокой способностью к каллусообразованию и регенерации может способствовать получению сомаклональных вариантов и их дальнейшему использованию в селекционной работе (Сидоров, 1990).

Важным фактором, влияющим на регенерационный потенциал и сомаклональную изменчивость, является тип экспланта. Так, например, регенеранты, полученные из мезофильных тканей листа картофеля, отличались значительно меньшей частотой сомаклональных вариантов в сравнении с регенерантами, полученными из каллуса, для индуцирования которого использовались лепестки и оси соцветия (12.3% и 50,3% сомаклонов соответственно).

Влияние условий культивирования и регенерации растений. Главным фактором культивирования клеток и тканей in vitro, определяющим частоту сомаклональной изменчивости, является гормональный баланс, определяющий клеточный и тканевый гомеостаз. Нарушение гормонального баланса, в особенности под воздействием гормонов питательной среды, может приводить к нарушениям в митозе и цитогенетической разнокачественности клеточных популяций. Кроме гормонов, на сомаклональную изменчивость могут влиять и другие компоненты питательной среды (макрои микроэлементы, сахароза, витамины), а также физические условия культивирования.

Состояние каллусогенеза, а также длительность неорганизованного роста клеточных культур усиливают частоту появления сомаклонов. Поэтому число мутаций у регенерантов, полученных при непрямом органогенезе или эмбриогенезе, выше по сравнению с прямым.

Условия и направление регенерации также изменяют частоту отклонений у регенерантов. У регенерантов, полученных методом соматического эмбриогенеза цикл развития «дедифференцированная клетка-растение» короче, и частота отклонений меньше в сравнении с органогенезом (Сидоров, 1990).

Для направленного регулирования генетических процессов in vitro и снижения частоты сомаклональной изменчивости в суспензионной культуре и культуре протопластов подобраны специальные среды. Это особенно важно и при клональном микроразмножении растений, где сомаклональная изменчивость нежелательна.

Таким образом, правильно выбирая генотип, эксплант и условия культивирования in vitro, можно увеличить или уменьшить частоту мутаций в соматических тканях клеточных культур.

Частоту и спектр сомаклональной изменчивости можно усилить, используя химические и физические мутагены. Объектами обработки служат каллус, суспензионная культура или культура протопластов. При воздействии мутагенов на клетки каллуса возможно образование тканей, а затем и регенерантов-химер. Возможно также использование эксплантов (семена, зародыши, пыльца и др.), подвергшихся обработке мутагенами.

В качестве химических мутагенов часто используют нитрозогуанидин (НГ); нитрозо-метил (этил) мочевину (НММ, НЭМ); метил (этил) метансульфонат (ММС, ЭМС). Физическими мутагенами могут служить облучение ультрафиолетом УФ, — квантами ⁶⁰Со и нейтронами. Строят кривую зависимости летального действия мутагена от его дозы. Обычно применяют концентрации химического мутагена, дающие летальный эффект 20−50% (Шамина, 1984). Более высокие дозы могут быть нежелательны, вызывая побочные мутационные изменения (ингибирование регенерации и др.).

Клеточная селекция предполагает отбор естественных или индуцированных мутантов in vitro на клеточном уровне, регенерацию из них растений и идентификацию мутаций в R₀ — потомстве. Для отбора клеток с желательными признаками используют селективные среды, в основном обеспечивающие системы резистентности к стрессовым воздействиям. В. А. Сидоров (1990) выделяет следующие приемы для отбора мутантных клеток:

• 1. Прямая (позитивная) селекция, при которой выживает определенный мутантный тип клеток;
• 2. Непрямая (негативная) селекция, основанная на избирательной гибели делящихся клеток дикого типа и выживании метаболически неактивных клеток, но требующая дополнительной идентификации у них мутационных изменений;
• 3. Тотальная селекция, при которой индивидуально тестируются все клеточные клоны;
• 4. Визуальная селекция и неселективный отбор, когда мутантная линия может быть идентифицирована среди всей популяции клеток визуально или при использовании биохимических маркеров.

Наиболее распространенной является прямая селекция, основанная на отборе клеток с желаемыми признаками на устойчивость к стрессовым воздействиям (патогены, гербициды, засоление, неоптимальная температура, высокие или низкие значения рН, тяжелые металлы и др.). Как правило, селективные агенты добавляют в состав питательной среды. Для выделения сомаклонов, устойчивых к патогенам, используют среду с токсином, выделяемым патогеном или с культуральной жидкостью, в которой развивался патоген. Для создания форм, устойчивых к засолению, в состав питательной среды добавляют соли Na Cl, Na₂ SO₄.

Для отбора форм с повышенным содержанием незаменимых аминокислот в среду добавляют их токсические аналоги. При этом происходит накопление в клетке основной аминокислоты. Так, например, резистентные к метионинсульфоксилу клетки моркови содержат в 200 раз больше метионина, а резистентные к аминоэтилцистеину накапливают лизина в 50 раз больше, чем в контроле (Шамина, 1984).

Схему прямой селекции мутантов можно представить следующим образом (Сидоров, 1990 с дополнениями):

• 1. Выделение каллуса, протопластов или суспензионной культуры;
• 2. Возникновение спонтанной сомаклональной изменчивости в культуре клеток, или ее индуцирование химическими или физическими мутагенами;
• 3. Культивирование клеток в неселективных условиях;
• 4. Культивирование клеток на селективных средах (отбор клеточных вариантов);
• 5. Культивирование колоний клеток на регенерационных средах;

Регенерация растений и их размножение (проведение тестов на устойчивость, биохимические анализы);

7. Высадка растений в почву (тестирование на устойчивость семян, изучение генетической природы устойчивости).

Клеточная селекция растений во многом напоминает селекцию микроорганизмов, и, несмотря на определенные трудности, имеет ряд преимуществ перед традиционными методами отбора:

возможность оперировать с миллионами клеток;

направленный характер селекции благодаря использованию селективного фона;

— возможность перенесения процедуры отбора в лабораторные условия, отсутствие сезонности в работе, контролируемые условия эксперимента и воспроизводимость результатов.

Обязательным условием успешной клеточной селекции является соблюдение следующего принципапризнак растения, по которому ведется отбор, должен проявляться на клеточном уровне.

В ряде исследований установлено, что сомаклональная изменчивость растений проявляется по различным качественным и количественным признакам (биохимическим, физиологическим, морфологическим и др.) Многие сомаклональные варианты, превосходящие исходные сорта по хозяйственно-ценным признакам (урожайность, устойчивость к биотическим и абиотическим стрессам, качество и др.), представляют большой интерес для селекционеров. Генетический анализ мутаций в соматических клетках показал, что мутации могут быть рецессивными, доминантными, кодоминантными. Мутанты могут быть гомо-или гетерозиготными. Мутации могут касаться как моно-, так и полигенных признаков и иметь место в различных хромосомах. Частота мутаций может быть достаточно высокой (например, у томата она может составлять около одного мутанта на каждые 20−25 растений-регенерантов).

В.А. Сидоров (1990) изучал сомаклональную изменчивость среди протоклонов картофеля, полученных от сорта Зарево. Было получено 320 растений, изученных в полевых условиях (табл. 3). Лишь 20% протоклонов оказались идентичны исходной форме. Около половины растений регенерантов оказались тетраплоидными, в то время как остальные — анеуи миксоплоидными формами. Спектр изменчивости среди растений — регенерантов был намного шире при обработке протопластов мутагеном. Ряд форм превышал исходный сорт по урожаю клубней, их количеству и массе, а также содержанию сухого вещества, крахмала и сырого протеина.

Таблица 3. Изменчивость среди протоклонов картофеля по основным количественным признакам (сорт Зарево).

Примечание. х—значение признака у исходного сорта, х_max и x_min — максимальное и минимальное значения признака, — среднее арифметическое, у — стандартное отклонение, v — коэффициент вариации; коэффициент вариации у данного сорта по урожайности находится в пределах 5—10%.

Методами клеточной селекции получены линии кукурузы, устойчивые к гельминтоспориозу; картофеля — к альтернариозу, фитофторозу, парше, с более высокой урожайностью, повышенным содержанием протеина и крахмала; линии люцерны с повышенным содержанием метионина; линии люцерны, табака, картофеля, пшеницы, риса, устойчивые к повышенному содержанию в почве солей; формы томата, устойчивые к фитофторозу. Все это свидетельствует о перспективности использования клеточной селекции как принципиально новой селекционной технологии улучшения растений.