Радиоиммунная терапия. 
Ядерная медицина: физические и химические основы

Радиотерапия широко использует методы иммунной терапии.

Иммунотерапия — терапия, при которой для лечения рака или уменьшения побочных действий от лечения рака используют защитные механизмы организма с целью укрепления или восстановления естественного иммунитета. Биологическое лечение называют также прицельным лечением, что означает, что антироковое лекарство атакует конкретные мишени в раковой клетке или факторы, способствующие развитию опухоли.

В иммунотерапии используют моноклональные антитела, ингибиторы ангиогенеза (лечение, препятствующее возникновению сосудов в опухоли), интерфероны и вакцины.

Антитела в организме человека распознают типичные структуры (антигены), располагающиеся на наружной поверхности раковых клеток. Моноклональные антитела по своей природе являются белками. Они атакуют раковые клетки в организме. Антитела по-разному влияют на раковую клетку^г. Чаще всего антитело узнаёт раковую клетку' по антигену на её поверхности. В таком случае лекарство связывается с антигеном и извещает иммунную систему организма о больной клетке, которую нужно уничтожить. Кроме того, связывание с антигеном препятствует развитию раковой клетки, в результате чего тормозится деление раковых клеток и распространение в другие ткани и органы, т. е. метастазирование.

Таким образом, яды, содержащиеся в антителах, могут прицельно воздействовать на злокачественные клетки. Некоторые антитела имеют прямой повреждающий клетки эффект воздействия. Лечение антителами возможно лишь тогда, когда видоизменившиеся клетки несут на своей поверхности антиген.

Антитела (иммуноглобулины, ИГ, Ig) — растворимые гликопротеины, присутствующие в сыворотке крови, тканевой жидкости или на клеточной мембране, которые распознают и связывают антигены. Иммуноглобулины синтезируются В-лимфоцитами (плазматическими клетками) в ответ на чужеродные вещества определенной структуры — антигены. Антитела используются иммунной системой для идентификации и нейтрализации чужеродных объектов — например, бактерий и вирусов. Антитела выполняют две функции: антигенсвязывающую функцию и эффекторную (например, запуск классической схемы активации комплемента и связывание с клетками), являются важнейшим фактором специфического гуморального иммунитета, состоят из двух лёгких цепей и двух тяжёлых цепей. У млекопитающих выделяют пять классов иммуноглобулинов — IgG, IgA, IgM, lgD, IgE, различающиеся между собой по строению и аминокислотному составу тяжелых цепей. Иммуноглобулины экспрессируются в виде мембранносвязанных рецепторов на поверхности В-клеток и в виде растворимых молекул, присутствующих в сыворотке и тканевой жидкости. Молекулярная масса антител варьирует от 160 тыс. (IgG) до 1 млн Да. (IgA и IgM). Моноклональные антитела — антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону, т. е. произошедшими из одной плазматической клетки-предшественницы. Моноклональные антитела могут быть выработаны на почти любое вещество (в основном белки и полисахариды), которое антитело будет специфически связывать. Они могут быть далее использованы для обнаружения этого вещества или его очистки. В случае их использования в качестве лекарства его название оканчивается на — mab. Антиген и иммуноген («производитель антител») — вещество, которое организм считает чужеродным или потенциально опасным. Против антигена организм вырабатывает собственные антитела (иммунный ответ). Под иммуногенами понимают все соединения, которые могут быть распознаны иммунной системой. Иммуногены — это вещества (свои или чужие), которые вызывают ответ иммунной системы. Антигены — чужеродные вещества (белки или полисахариды), которые организм блокирует выработанными антителами. Антигены, как правило, являются белками или полисахаридами и представляют собой части бактериальных клеток, вирусов и других микроорганизмов. Липиды и нуклеиновые кислоты проявляют антигенные свойства в сочетании с белками. Однако простые вещества, даже металлы, также могут становиться антигенами в сочетании с собственными белками человеческого организма и их модификациями. Они называются гаптены (haptens). Антигены нелшкробного происхождения — это в частности пыльца, яичный белок и белки трансплантатов тканей и органов, а также поверхностные белки клеток крови при гемотрансфузии. Клеточный рецептор — молекула (обычно белок) на поверхности клетки, специфически реагирующая изменением своей пространственной конфигурации на присоединение к ней молекулы определенного химического вещества, передающего внешний регуляторный сигнал и, в свою очередь, передающая этот сигнал внутрь клетки. Вещество, специфически соединяющееся с рецептором, называется лигандом этого рецептора. Внутри организма это гормон или нейромедиатор либо их искусственные заменители, применяемые в качестве лекарственных средств. Некоторые лиганды блокируют рецепторы (антагонисты).

Рис. 7. Взаимодействие иммунного РФП с раковой (а) и нормальной (б) клетками.

При использовании ингибиторов ангиогенеза мишенью является фактор роста, способствующий развитию виутриопухолевых сосудов. Фактор роста запускает возникновение новых сосудов в ткани опухоли и тем способствует её рост>^т. Сосуды снабжают опухоль кислородом и питательными веществами. Ингибиторы ангиогенеза вызывают дегенерацию сосудов в ткани опухоли, вследствие чего тормозится развитие опухоли и уменьшается распространение опухоли в другие органы и ткани.

Интерфероны (белки) или цитокины (пептиды) — это молекулы, активирующие защитную систему организма в направлении уничтожения раковых клеток.

Цель вакцин — найти в организме раковые клетки и «разбудить» иммунную систему самого человека, которая уничтожит раковую клетку'. Задача раковых вакцин — предупредить заболевание, а не вылечить его. Таргетная (прицельная) терапия — лечение лекарственными средствами, избирательно. воздействующими на определенную молекулярную мишень или на фундаментальные молекулярные механизмы, лежащие в основе того или иного заболевания, в частности, на мишени, свойственные опухолевым клеткам.

Мишенями для фармпрепаратов (в том числе — радиоактивных) могут быть отдельные молекулы на поверхности клетки — рецепторы различных сигнальных путей, играющие важную роль в патогенезе злокачественного процесса, или структурные компоненты клетки, внутриклеточные белки — посредники в передаче сигнала, отдельные молекулы РНК или структурные элементы генов. Есть несколько разных подходов к использованию этих мишеней. Первый заключается в использовании активной (вакцины) или пассивной (моноклональные антитела) специфической иммунотерапии, в основе механизма действия которой лежат опухолеассоциированные антигены и иммунологические механизмы. Другой подход направлен на блокирование отдельных сигнальных каскадов, жизненно необходимых для существования опухолевой клетки, с помощью, так называемых, «малых молекул». Третий подход заключается в использовании моноклональных антител или лигандов рецепторов в качестве средств доставки радиоизотопов или токсинов, оказывающих избирательное действие на опухолевый процесс.

Радиоиммупная терапия — направление лечения, при котором радиоактивная молекула пришивается к моноклональному антителу. Это позволяет направить лучевую терапию прямо в опухоль.

Термин РИТ (радиоимунная или радиоизотопная терапия) обычно относят к терапии с помощью электронов, но иногда используют как синоним мишенной терапии в целом.

Радиоиммунотерапия используется для лечения ранних стадий практически всех онкологических и некоторых инфекционных заболеваний (например, менингита), т. е. когда мишенями являются клетки или небольшие кластеры.

В радиоиммунной терапии лечение раковых клеток крови проводится антителами, которые предварительно связываются с радиоактивными веществами. Извлечённые из организма антитела, метятся радиоактивным изотопом, а затем инъецируются в кровяное русло. Сцеплённые с ними радиоактивные вещества разрушают раковые клетки при непосредственном контакте.

Схема доставки РФП на поверхность злокачественной опухоли представлена на рис. 8. Рецептор-специфичный РФП включает в себя изотоп — источник ионизирующего излучения; комплексообразующую молекулу (например, хелатор), осуществляющую прочную связь с радионуклидом, но ещё способную образовывать связи с другими молекулами, например, линкером; линкер — промежуточную молекулу-транспортёр, осуществляющую связь между меченой молекулой и антителом; и молекулывектора (белок, пептид или антитело), транспортирующей излучатель к мишени. Достигнув опухоли, РФП прикрепляется к рецепторам, расположенным на поверхности опухоли, после чего начинается её облучение.

Выше мы рассмотрели случай использования РФП для борьбы с достаточно крупными опухолями, но существуют молекулы-векторы, предназначенные для поиска и уничтожения отдельных раковых клеток. Такие РФП способны проникать не только в опухоль и в её клетку, но внедряться в ядро клетки и даже присоединяться в молекуле ДНК (рис. 9). Воздействуя непосредственно на ДНК, оже-электроны эффективно разрушают двойную спираль, так что восстановление её становится практически невозможным. Но эффективность борьбы с раком связана не только с радиацией: молекула-вектор заимствована из арсенала химиотерапии — она сама, без всякой радиации, способна разрушить злокачественную клетку. Действуя совместно, химиотерапия и РИТ терапия становятся важным методом лечения онкологических заболеваний. В РФП для РИТ в качестве вектора используются моноклональные антитела, способные воздействовать на внутриклеточную сигнализацию, такие как транстузумаб, ритуксимаб, сетуксимаб, бевацизумаб.

Вектор — переносчик — молекула-транспортер для направленной (адресной) доставки лекарственных веществ. Его задача — обеспечение поступления биологически активных соединений (лекарств, токсинов, белков, олигонуклеотидов, генов и т. д.) в целевые клетки организма, в том числе в требуемый внутриклеточный компартмент (ядро, цитоплазма, органеллы), в очаг патологического поражения, одновременно предотвращая инактивацию и проявление биологической активности этих веществ до накопления в заданной области.

Важной задачей радиоиммунотерапии является разработка способов целенаправленной доставки генов в клетки-мишени организма: необходимо доставить ген именно в те клетки, в которых он и должен функционировать. Требуется создать такой вектор, который защищал бы рекомбинантную плазмиду со встроенным геном от действия нуклеаз крови, и, в то же время, имел бы стимулятор для проникновения ДНК в клетки. Сейчас в качестве стимуляторов проникновения ДНК в клетки применяется ДЕАЕдекстран, фосфат кальция и некоторые другие.

Перспективной считается конструкция молекулярного вектора, которая представляет собой вирусоподобную частицу, в центре которых находится рекомбинантная плазмидная ДНК с доставляемым геном, а на поверхности — антитела к клеткам-мишеням. Антитела входят в состав конъюгата: спермидин-полиглюкин, который несёт две функции: удерживает конъюгат на отрицательно заряженной ДНК за счёт положительного заряда спермидина и в то же время является аналогом ДЕАЕ-декстрана (диэтиламиноэтилдекстрана), стимулятора проникновения молекул ДНК в клетки. Для сборки молекулярного вектора создают рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую доставляемый ген. Антитела к клеткам-мишеням получают, иммунизацией антигенами (клетками-мишенями или их компонентами) с последующей выделением антител из сыворотки крови.

Обычно в состав вектора входит наноконтейнер, в который упаковывают терапевтические субстанции, и система адресной доставки, расположенная на внешней поверхности наноконтейнера. В качестве наноматериалов для создания векторов используют наночастицы из биосовместимых линейных полимеров (полиэтиленгликоль, полимолочная кислота и др.) и разветвлённых полимеров, липосомы, а также вирусные частицы, лишенные способности к размножению. Для адресации наноконтейнеров их модифицируют молекулами, узнающими поверхностные рецепторы клеток-мишеней, например, антителами к этим рецепторам, молекулами фолиевой кислоты и др. Предложены векторные системы доставки лекарств без наноконтейнеров, в которых адресная молекула непосредственно прикрепляется к лекарственному веществу. Так, с помощью генноинженерных технологий создана гибридная молекула, состоящая из антитела к рецептору ферритина на поверхности клеток и связывающего биотин белка — авидина. Доставляемые вещества модифицируют биотином, и они прочно связываются с авидином. Затем такие комплексы доставляются к клеткам, в частности, к клеткам центральной нервной системы путём активного транспорта через эндотелий капилляров мозга.

В некоторых органах (печень, лёгкие, селезенка) можно достигнуть повышенного накопления наноконтейнеров с лекарствами даже без применения специфической адресации. Это связано с естественной барьерной функцией этих органов. Накопление происходит в опухолях, снабжаемых кровью по высокопроницаемым микрососудам, в результате чего даже крупные молекулы и частицы из крови легко переходят в межклеточное пространство. Однако разница в степени накопления терапевтических агентов в опухоли и в здоровой ткани зачастую невелика, поэтому требуется разработка высокоспецифичных адресных молекул или других методов наведения, чтобы сделать векторы высокоточными «магическими пулями».

При создании препаратов для радиоиммунной терапии важен правильный выбор линкера. Например, в качестве линкера может выступать двухцепочечная молекула ДНК, содержащая какой-либо сайт рестрикции. Такая молекула используется в генной инженерии для соединения векторной плазмиды и клонируемой последовательности ДНК, к концам которой по методу' сшивания тупых концов присоединены линкеры.

Сайт рестрикции (участок узнавания) — короткая последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК, которая распознаётся ферментом эндонуклеазой рестрикции-модификации (рестриктазой).

Линкер соединяет меченую молекулу с вектором. Меченая молекула обычно несёт ион металла — радионуклида, испускающего ожеэлектроны или электроны конверсии. Для прочной фиксации металла обычно используют хелатирующие агенты. Например, упомянутый ранее хелатор ДОТА активно захватывает ион 9°Уз+ и одновременно легко соединяется с антителами. Подобные препараты имеют названия, заканчивающиеся на тетраксетан: иттр1ш-[9°У]-кливатузумабтетраксетан, иттрий- [9оу]-такаеузумабтетраксетан и др.

Сродством к соматостатиновым рецепторам, существующим на нейроэндоктринных опухолях, обладают такие препараты, как DOTATOC, DOТА-(Туг'^-остреотид или эдотреотид и DOTA-TATE или DOTA-(Tyrя) — остреотад. Сродством к протеинам, стрептавидиму и авидину обладает ДОТА-биотин, что позволяет нацелить радиоактивную метку на опугхоли с помощью моноклональных антител.

Замечание. В русскоязычной биохимической литературе широко используются сокращения, аббревиатуры и термины на английском языке. Так, например, иод названием DOTATOC (хелат ⁹°Y, рис. и) скрыто соединение 2-[4-[2-[[(2/0^-1~ [[(4R>7S>ioS, i3R, l6S, i9R)-io-(4-im ohuty)-4-[[(2R, 3R)-i, 3-dihydroxybutan-2- yl]carbamoy[]-7-[(iR)-i-hydroxyethyl]-i6-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-i3-(iH-indol-3- yImethyl)-6,g_ti2,i5,i8-pentaoxo-i, 2-dithia-5,8,u, i4, iy-pentazacycloicos-ig-yl]amino]- i-oxo-3-phenylpi'opan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]-^,7, io-bis (ca7'boxymethyl)-i,4_>7, iotet7'azacyclododec—yl]acetic acid. В этой части книги мы также будем придерживаться этой тенденции.

Табл. 1. Радионуклиды, используемые в настоящее время для мечения моноклональных антител и производства РФП для радиотерапии рака.

Изотоп.	T, час.	Излучение.	Максимальная энергия, кэВ.	Максимальный пробег, мм.
131J.		P.	6ю.	2,0.
9оу.		p.		12,0.
‘77LU.		p.		1,5.
6" Си.		S.		1,8.
l86Re*.		ft.		5,0.
.88Re.		к.		11,0.
2,2Bi.		p.	878O.	0,09.
213Bi.	0,77.		>6000.	<0,1.
2uAt.	7,22.	a.		0,08.

*) Имеет место и у-эмиссия.

В радиоиммунной терапии используются различные радионуклиды, являющиеся источниками разных видов излучений, которые могут быть присоединены к векторам для доставки в опухоли. К ним относятся: р-излучатели: *3iJ (например, [*3"J]-jNP-4, [^{, 3,}J]-/iMiVi4, [^{, 31}J]-CC49, [^{, 3,}J]- ChL6, [¹³¹J]-B72.3, [¹³¹Л]/1-тозитумаб); ⁹°Y (например, [9°Y]-cT84.66, [⁹°Y]- R1549, [⁹°Y]-HMFG-i, [*>Y]-MLN59iRl, (>У]-7Б4.66, [⁹«Y]-JVA:-DTPA-BrE-3, [⁹°У]-ибритумомаб), ‘^Lu (например, [^l^Lu]-MLN5<)iRl и [^l^Lu]-CC49) ^и l86Re (например, [^l86Re]-pi85//ER2)); излучатели низкоэнергетичных ожеэлектронов и электронов внутренней конверсии: ^ш1п (например, [^ш1п]- 2lT-BAD-mY70) ¹¹4^mIn, ¹²³J, ¹²sj, 99""Xc и ⁶?Ga); а-излучатели: ²²³Ac/²¹³Bi, ²²⁷Ac/²²³Ra, 23ou/226xh (генераторы), ²²?Th,^{Tb, 21}°Po и ²ⁿAt.

Ранее изотопы йода вводили пациенту в виде простых солей (например, в виде йодида натрия), что было достаточно для лечения заболеваний щитовидной железы. Однако, для борьбы с солидными опухолями (^{, 3,}J) и циркулирующими злокачественными клетками (¹²⁵J), изотопы йода приходится включать в значительно более сложные соединения, обладающие биологической активностью.

Одно из перспективных направлений радионуклидной терапии, основано на использовании меченых радионуклидами пептидов (или комбинации различных пептидов, меченных одним или разными радионуклидами).

Пептиды (греч. лелтод — питательный) — семейство веществ, молекулы которых построены из остатков а-аминокислот, соединённых в цепь пептидными (амидными) связями —C (0)NH—. Это природные или синтетические соединения, содержащие десятки, сотни или тысячи мономерных звеньев — аминокислот. Полипептиды состоят из сотен аминокислот, в противоположность олигопептидам, состоящим из небольшого числа аминокислот (не более ю-r^o), и простым пептидам (до ю).

Меченные радионуклидами пептиды позволяют бороться с опухолями, которые обладают пептидными рецепторами и устойчивы к препаратам химиотерапии.

Пептидные производные с молекулярным весом менее 1500 — альтернатива антител. Они существуют в организме, поэтому имеют склонность взаимодействовать с рецепторами, расположенными на клеточных мембранах. Рецепторная пептидная радионуклидная терапия позволяет уменьшить величину радиационной дозы, необходимой для борьбы с опухолями. Биологическая основанность подобного лечения базируется на хорошей кинетике проникновения и удержания в клетке радиопептида, что способствует успешному лечению, которое требует, чтобы время пребывания радионуклида в клетке соответствовало его периоду полураспада.

Преимущество пептида малых размеров заключается в быстром проникновении в ткани (из-за его гидрофильных свойств), в быстром клиренсе и низкой антигенности, а так же в лёгкости и дешевизне производства. Пептиды не могут преодолеть неповрежденные барьеры кровь/мозг (гематоэнцефалические барьеры), но способны проникать через нарушенные барьеры, существующие в недифференцированной глиобластоме. Небольшие изменения в размерах пептидов приводят к существенным изменениям в распределении радиопептида. Пептиды удаляются из тела через почки и способны накапливаться в них. Это обстоятельство следует учитывать при проведении терапии радиоактивными пептидами.

Радиопетидная терапия назначается больным раком с многократными неоперируемыми метастазами, причём опухоль должна экспрессировать (отображать на поверхности) соответствующий пептидный рецептор, а плотность рецепторов должна быть достаточно высокой, чтобы обеспечить требуемую радиационную дозу. Размер опухоли не влияет существенно на эффективность пептидной терапии. В пептиды удаётся включить различные радионутслиды, которые можно использовать как для получения томографических изображений, так и для терапии.

При сравнении терапевтической эффективности различных элементов было обнаружено, что злокачественные опухоли поглощают намного больше антител, меченных ^ш1п, чем меченных ^IUJ, поэтому с точки зрения борьбы с опу^гхолями эффективность использования изотопов металлов выше изотопов галогенов. К сожалению антитела, меченные индием, сильнее, чем меченные йодом накапливаются в почках и печени, что является крайне нежелательным процессом, поскольку облучаются органы никакого отношения к онкологии не имеющие. Кроме того, йод выводится из организма с мочой, тогда как индий — через желчный пузырь, что также свидетельствует в пользу йодом меченных моноклональных антител.

Молекулы антител, меченные радиоактивным металлом, довольно объёмны, гидрофильны и к тому же несут электрический заряд. Они не десгруктируют в фосфолипидных мембранах и не могут проникать сквозь них. Поэтому они оказываются захваченными в клетках и прочно удерживаются в них. Удаляются они из клеток за счёт медленных процессов экоцитоза. Это — одна из причин повышенного накопления радиоактивных металлов в опухоли. Радионуклиды металлической природы ¹⁷⁷Lu, 9°Y, ²²sAc, ^2,sBi, ^2:*Bi обладают хорошими свойствами «осёддости», если находятся в устойчивых хелатах и соединены с белками и пептидами.

Изотопы йода (*3*J и ^l25j) обладают привлекательными для терапии ядерно-физическими свойствами, кроме того йод образует широкий набор химических соединений и на его основе можно создать большое разнообразие РФП, применимых для решения различных проблем онкологии. Важно, что в препаратах, созданных для йода, йод можно легко заменить на радиоактивный бром или астат, что ещё увеличивает диапазон применения препаратов.

В качестве линкера при работе с йодом можно использовать как незаряженное, так и положительно или отрицательно заряженное соединение. Положительно заряженные линкеры, включающие галопиридинкарбоксилат или гуанидинметилгалобеизоат, демонстрируют повышенное удержание в клетках по сравнению с неполярными нейтральными линкерами. Использование устойчивой D-аминокислоты, содержащей основной пептид D-Lys-D-Arg-D-Tyr-D-Arg-D-Arg (D-KRYRR) как линкер для радиоактивного йода позволило увеличить заряд и молекулярный вес трассера, что увеличило клеточное удержание РФП. Захват опухолью и удержание в случае меченного йодом D-KRYRR сопоставимы с удержанием антител, меченных радиоактивными металлами. Недостатком D-KRYRR является высокое поглощение и удержание радиоактивности в почках и печени. Понизить удержание йода в почках можно применением отрицательно заряженных линкеров, например, closo-dodecaborate, closo-decaborate, Nsuccinimidyl 3-iodo-['3'J]-4-phosphonomethylbenzoate, и D-пептидов с высоким отрицательным зарядом из-за включения глутамата в ДТПА.

Недостатком РФП, в больших количествах поглощаемых опухолями, является не только то, что они поступают в печень и почки, по и то, что они накапливаются и удерживаются в нормальных тканях, увеличивая вредную радиационную нагрузку на них. Для устранения этого недостатка используют маленькие фрагменты антител и пептидных лигандов, т.к. в отличие от моноклональных антител они короткое время пребывают в крови, что уменьшает гематологическую токсичность.

Новые терапевтические РФП характеризуются высокой функциональной эффективностью, а также клинической и радиационной безопасностью. Это, прежде всего: [^,5з8ш]-оксибифор; микросферы альбумина, меченные ^{, 6}sDy, ^{, 66}Но, 9°Y; йодомикс (смесь *33j, >3ij_f waj); микросферы альбумина и оксиэтилидендифосфорная кислота, меченные ^{, 88}Re; РФП на основе [¹⁶⁶Но]-РАТ-7; пептиды, меченные ^{, 88}Re и 9°Y, РФП с а-излучателями.

Медь-67 (62 ч, р-излучатель) применяется в виде [⁶?Си]-моноклоналыюго антитела для радиоиммунотерапия рака толстой кишки и неходжкинекой лимфомы Скандий-47, (3.4 дн) используется в виде [^Scl-моноклональное антитело для радиоиммунотерапии опухолей.