Изучение транспортных АТФазных систем изолированных плазматических мембран клеток флоэмы борщевика

Вопросы транспорта веществ через биологические мембраны привлекают в настоящее время всё большее внимание исследователей (Лев, 1974, Кларксон, 1975, Веренинов, 1978, Котык, Яначек, 1980). Установлено участие в транспортных процессах, и, прежде всего, в активном транспорте ионов против их электрохимических градиентов, специализированных ферментных систем. Особое место среди этих систем занимают транспортные аденозинтрифосфатазы (АТ?азы). Являясь основой ионных насосов, транспортные АТФазы сопрягают гидролиз АТФ с транспортом соответствующих ионов.

В настоящее время наиболее хорошо изученными транспортными АТвазными системами являются Н+~А1Фаза, Иа*К±А!1Фаза и Са^+# м^±А1Фаза. На изолированных мембранных структурах исследованы их биохимические и транспортные свойства (Mitchell, 1966, Скулачев, Козлов, 1977, Болдырев, 1978, Мартиросов, 1980, Гершанович, 1980, Schuurmans Stekhoven, Bonting 1981). Встраивая очищенные АТФазные белки в искусственные фосфолипидные мембраны, удалось убедительно показать роль этих белков в процессах переноса определенных ионов через мембраны (Рэкер, 1979).

Транспортные АТФазы плазматических мембран растительных клеток стали изучаться в самое последнее время. Пока не совсем ясно, какие типы АТФаз функционируют в плазматических мембранах клеток высших растений. Вопрос осложняется тем, что растительные клетки в отличие от животных и микроорганизмен-ных клеток 1фоме плазмалеммы имеют еще одну мембрану — тоно-пласт, в которой, как и в плазмалемме, функционируют активные транспортные системы. Предполагают, что в плазматических мембранах клеток высших растений находятся катион-стимулируемые.

АТФазы, а в мембране тонопласта — анион-стимулируемые АНа-ЗЫ с Poole, (c)78, Sze, 1982).

Рядом исследователей показано наличие в ппазмалемме клеток высших растений К±зависимой АТФазы (Hodges «1976, Leonard, Hotchkiss «1976), Имеются немногочисленные данные, свидетельствующие о работе в растительных плазматических мембранах Na+, К±АТФазы С Kylin, 1973, Тихая и др., 197б). Косвенные данные о функционировании в плазма-лемме клеток высших растений Н+~насоса (Poole t 1978^ Лялин, 1979, Воробьев, 1980, Bentrup, J980), позволяют сделать предположение о наличии в этих мембранах Н±АТ?азыТаким образом, вопрос о типах АТФаз, функционирующих в плазматических мембранах клеток высших растений, пока остается ОТБЫТЫМ*.

До последнего времени не было прямых экспериментальных доказательств, свидетельствующих об участии АТФазных систем в транспорте различных ионов через плазматические мембраны растительных клеток. Как правило* исследования в этой области проводились на целых растениях или на отдельных растительных тканях и велись или в плане обнаружения определенных АТФаз-ных систем и косвенно доказывалось их возможное участие в транспорте тех или иных ионов, или в плане изучения транспорта различных ионов (К+, Na+, Н+, С1~) и возможного участия в транспортных процессах АТФаз.

До настоящего времени большая часть работ по изучению растительных АТФазных систем была проведена на корнях растений. Исследователи обоснованно полагали наличие в тканях корня активных транспортных систем, принимающих участие в поглощении корнями питательных веществ из почвы. Исследование АТФазных систем других растительных тканей позволит выявить универсальность или специфичность этих систем* Особый интерес в связи с этим может иметь исследование проводящей ткани флоэмы, основной функцией которой является транспорт ассимиля-тов, что позволяет предположить функцион>фование в плазма" лемме клеток этой ткани активных транспортных механизмов;

В связи с вышеизложенным в задачи представляемой работы входило:

1 — выявление типов АТЕаз, функционирующих в плазмалемме клеток флоэмы высших растений,.

2 изучение биохимических свойств выявленных АТФаз,.

3 — доказательство участия обнаруженных АТФаз в транспорте определенных катионов через плазматические мембраны.

Наиболее убедительно поставленные задачи можно решить при исследовании их на фракции изолированных плазматических мембран. Поэтому одна из частных задач работы состояла в получении фракции, обогащенной плазматическими мембранами клеток флоэмы." .

В результате проведенных исследований на изолированной фракции плазматических мембран впервые было показано, что в плазмалемме клеток флоэмы высших растений функционируют две АТФазные системы: Н+"*А1Фаза и Иа+, к+~АТФаза. Показано, что обе А1Фазы работают в кислой области рН. Первая имеет оптимум рН 6,0, вторая рН 6,5'. Изучены их некоторые биохимические свойства: субстратная специфичность, кинетические параметры катализируемых реакций, отношение ферментов к действию некото" рых однои двухвалентных катионов. Получены данные, свидетельствующие, что растительные плазмалемные АТФазы имеют ряд особенностей, отличающих их от аналогичных систем, функ 8 м ционирующих в плазматических мембранах клеток животных и микроорганизмов.

Впервые получен комплекс прямых экспериментальных данных, показывающих, что обнаруженные АТФазы функционируют как транспортные системы. АТФ-зависимое изменение электрохимии ческого градиента протонов, возникающее на плазматической мембране, свидетельствует об участии АТФазы с оптимумом рН б, 0 в транспорте Н+. Вышедшая недавно работа, в которой показано изменение химического градиента Н+ при функционировании солюбилизированной АТФазы плазматических мембран клеток корней овса, встроенной В фосфолипидный бислой (Vara, Serrano, 1982), является хорошим подтверждением полученных нами результатов, свидительствующих о том, что основой протонного насоса плазмалеммы клеток высших растений является Н+~АТФаза.

Вторая АТФазная оистема с оптимумом рН 6,5 принимает участие в мембранном транспорте и Na. Было обнаружено АТФ-индуцированное изменение потоков К+ и Na+ через плаз* малемму клеток флоэмы в противоположных направлениях.

Полученные данные имеют определенное значение как в разработке в целом проблемы мембранного транспорта, так и в решении ряда актуальных задач физиологии и биохимии высших расте" ний. Они вносят определенный вклад в изучение процессов, с по" соботвующих передвижению ассимилятов и ионов во флоэме, что в перспективе может создать дополнительные возможности в регуляции этих процессов на мембранном уровне с целью улучшения полезных свойств сельскохозяйственных растений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Таким образом, в проведенных исследованиях впервые показано одновременное наличие в плазмалемме клеток флоэмы высших растений двух оптимумов катион-зависимой АТФазной активности в кислой области значений рШ Исследования проведены на фракции изолированных плазматических мембран, что позволило поставить и решить новые задачи в изучении АТФазных систем растительных клеток. Одна из таких новых задач состояла в изучении транспортных функций АТФазных систем плазматических мембран клеток высших растений;

Впервые показано наличие в плазмалемме клеток высших растений протонной АТИазы, Ей являлась АТФазная система с оптимумом активности рН 6,0. При данном значении рН наблюдали также АТФ-зависимые изменения электрохимического градиента протонов, что реально свидетельствует о выполнении указанной АТБазой ее транспортной функции — перемещении протона через плазматическую мембрану.

Результаты опытов по изменению величины дрН на плазмалемме в присутствии и отсутствии ионов К+ позволили сделать вывод о том, что АТФаза с оптимумом рН 6,0 связана также с транспортом ионов К+ внутрь растительной клетки.

Имея ряд общих черт с протонными АТФазами митохондрий (что явилось дополнительным фактом идентификации обнаруженной растительной АТ&азы как протонной). АТФаза плазмалеммы клеток флоэмы борщевика обладала некоторыми отличительными особенностями. В частности, она не ингибировапась олигомици-ном и была активна в кислой области рНПо своим биохимическим свойствам она больше напоминала Н±АТФазу плазматических мембран клеток некоторых бактерий и дрожжей.

Вторая АТФазная система с оптимумом активности рН 6,5 проявляла некоторые черты сходства с Иа+, К±А'Шазой плазматических мембран животных клеток. Она выявлялась только при одновременном присутствии в среде инкубации ионов К+ и.

Ка+, причем, проявляла максимум своей активности при определенном соотношении концентраций этих ионов, ингибировалась сердечным гликоэидом строфантином-К. Но данная АТФазная система имела и ряд отличительных черт от На+, К±АТ?азы плазмалеммы животных клеток. Оптимум ее активности лежал в кислой области, синергическое действие одновалентных катионов проявлялось при соотношении их концентраций, близком к I. Не выявлено ингибадющего действия на растительную АТФазу дициклогексилкарбодиимида и олигомицина.

Получены данные, свидетельствующие, что АТФазная система с оптимумом рН 6,5 участвует в транслокации одновалентных катионов Па + и К+ через мембрану. При данном значении рН наблюдали АТФ-зависимое электронейтральное перемещение К+ и.

Жа + через везикулярные мембраны в противоположных направлениях. Транспорт указанных катионов так же, как и активность фермента ингибировался строфантином-К.

Таким образом, исследуя транспортные функции А1Фаз плазматических мембран клеток флоэмы борщевика удалось впервые экспериментально показать прямое участие растительных АТФазных систем в транспорте одновалентных катионов. АТФаза с оптимумом рН 6,0 выводит из клетки Н+ и сопряженно участвует в накоплении в ней К+. Вопрос о том, происходит ли перемещение К+ при этом электрофоретически или по другому ме~ ханизму, пока остается открытым. Вторая АТФаза с оптимумом рН 6,5 выкачивает из клетки Na+ и накачивает внутрь К+.

Следует отметить, что в отличие от АТФаз плазматических мембран клеток микроорганизмов и животных, обнаруженные растительные АТФазы имели более высокие значения К для реакm ций, катализодемых ими, то есть обладали более низким сродством к субстрату. Истинным субстратом для обоих типов АТФаз в плазмалемме клеток флоэмы борщевика явился комплекс Mg «АТФ в соотношении концентраций 1:1.

Пока нельзя однозначно ответить, разные это АТФазы, функционирующие в плазмалемме клеток флоэмы борщевика, или более сложным образом организованная единая транспортная система, обеспечивающая энергией А1Ф транспорт Н+, К+ и Na + через плазматические мембраны. Теоретически существуют предпосылки для объяснения обоих вариантов.

При рассмотрении первого из них необходимо прежде всего упомянуть тот факт, что обычно поглощение К+ в 2−8 раза боль^-ше, чем выход протона из клеток корней растений (Pitman, 1970) У Можно было бы предположить, что Н+/К±насос этих клеток работает в режиме 2"© иона калия на I ион Н+, однако экспериментальных данных, подтверждающих такую стехиометрию работы насоса, нет. Как следует из работы по исследованию котранспорта Н+ с сахарами (Hutchings, 1978), стехиометрия Н+/К+ переноса, очевидно, 1:1. Поэтому более оправданным будет предположение о том, что в активном транспорте К+ через плазматические мембраны клеток высших растений участвует не одна, а, по тайней мере, две транспортные системы.

Вероятность работы двух систем в растительных клетках, обеспечивающих транслокацию К+ через плазмалемму, следует из результатов ряда работ по изучению транспортных процессов, проведенных на интактных растениях. Так, Выскребенцевой и Красавиной (1971) было показано, что в корнеплодах сахарной свеклы только часть К±потока ингибируется строфантином. Чес-ман И Хансон (Cheeseman, Hanson, 1980) при изучении транспорта К+ в клетках корней кукурузы обнаружили, что существует, по крайней мере, две системы, ответственные за калиевый транспорт. Они нашли ДЦКД-чувствительную систему, которая обеспечивала активное поглощение К+ из среды с низкой концентрацией К+. По мнению авторов функционирование этой системы обусловлено работой Н+, К±АТФазы. Вторая система, неизвестной для исследователей природы, была нечувствительна к действию ДЦКД и сохраняла активность при различных внеклеточных и внутриклеточных концентрациях К+. Высказанные выше предположения авторов о возможной работе в клетках высших растений двух систем, обеспечивающих накопление К+ внутри клеток, находят хорошее объяснение в свете полученных нами данных. Такими системами могут являться обнаруженные протонная и На+, К±АТФазы.

О возможном наличии в клетках высших растений одновременно двух насосов — протонного и натриевого — свидетельствуют также работа Хачатряна (1980) по действию различных ингибиторов на мембранный потенциал клеток высших растений. Как известно, мембранный потенциал представляет собой сумму диффузионных потенциалов и потенциалов, создаваемых активными насосами. В работе данного автора было показано, что генерация мембранного потенциала клетками корешков кукурузы может ингибироваться как ингибитором протонных насосов — ДЦВД, так и ингибитором Na + - насосов — оуабаином. Оуабаин деполяризовал мембрану на 20−25 мв, ЭДКД — на 70 мв.

Одновременное присутствие нескольких насосов, основой которых являются транспортные АТФазы, наблюдается в плазматических мембранах ряда животных клеток. По данным некоторых авторов в щазмалемме слизистой желудка функционируют Н+/Я+~АТФаза, Na+, К±АТФаза и НС0~-АТФаза (Линд, Тахе-пыльд, 1978), а обработка этой мембраны трипсином позволила выявить дополнительно скрытую активность Са-АТФазы, которая не зависела от присутствия в среде К+ (Nandi, Ray, Sen • (c)81). В плазмалемме клеток почечной ткани обнаружено четыре типа АТФаз: оуабаин-чувствительная, Na+, K±стимулируемая Mg ."зависимая АТФазаоуабаин-нечувствитель-ная Са2±стимулируемая АТФазаоуабаин-нечувствительная на—стимулируемая АТФаза и НС0д-АТ?аза (Perez-Gonzales, Proverbio, Whittembury, 1980). При изучении АТФаз микросомальной фракции кефали исследователи пришли к выводу, что в экскреции Na + через жабры участвует, кроме NatK±АТФазы, некоторая дополнительная^{-чувствительная} система (Pic, Ellory, Lucu, (c)79). Несколько типов АТФаз описаны в мембранах эритроцитов и тромбоцитов врови (Zade-Oppen, Schooler, Tosteson * 1979 * Sivertsen, 1981,.

Nelson, Rudnick, 1981, Бушнева, Иващенко, (c)81). Таким образом, результаты исследования АТФазных систем различных животных тканей позволяют признать возможным факт одновременного обнаружения двух транспортных АТФазных систем в плазма-лемме клеток флоэмы борщевика.

Возникают, однако, вопросы — оправдано ли для растительной клетки иметь две системы, способствующие накоплению К+ внутри её? Каковы их отношения между собой? Возможно, что два фермента делают всю систему в целом, с одной стороны, более лабильным образованием, предполагая взаимозаменяемость ее компонентов, а с другой стороны, повышает ее надежность. По мнению ряда авторов, активный транспорт некоторых ионов надежно осуществляется системой, состоящей из двух ферментов, обладающих ассиметричной функциональной структурой и различной зависимостью от рН'. Предложена и проанализирована математическая модель функционирования такой системы (Selegny, Vincent, В80).

Система с двумя ферментами и более четким разделением функции между ними позволяет расширить сферу их влияния на различные процессы жизнедеятельности клетки. Так протонная АТФаза, создавая на мембране электрохимический градиент протонов, может способствовать не только накоплению К+ в клетке, а, вероятно, даже в большей степени принимать участие в осуществлении вторичного транспорта других веществ, важных для жизнедеятельности клетки. Тогда как основной аспект функционирования^, К±АТФазы может состоять в обеспечении ионного гомеостаза клетки.

Вполне возможно, что два максимума АТФазной активности присущи исключительно клеткам проводящей ткани высших растений в связи с реализацией таких ее важнейших фунций, как латеральный и дальний транспорт ионов и веществ по ее адеткам, с одной стороны, и осуществление импульсного механизма передачи возбуждения у растений, с другой. Чаще всего исследователи, изучавшие АТФазные системы на других клетках высших растений, выявляли одну Независимую АТФазу, ингибируемую ДЦЦД. Гораздо реже выявлялась в плазмалемме клеток корней.

— 165, ца+, К±АТ?аза. Последнее обстоятельство может свидетельствовать или о наличии На-транспортной системы в плазматических мембранах корней далеко не всех растений, а, например, только солеросов (в корнях именно таких растений обнаруживали иа+, К±АТФазную систему) (Палладина, 1981, ИкЬауа, ж^сЬиа-Ыпа, 1981), или о том, что она может находиться в плазматических мембранах клеток высших растений не всегда в активном состоянии (Опритов, Крауз, 19 74) — Чтобы ответить на эти вопросы, необходимо провести более широкое исследование транспортных АТШазных систем на других тканях и органах высших растений.

Таким образом, предположение о том, что обнаруженные два оптимума АТ? азной активности в плазмалемме клеток флоэмы борщевика принадлежат двум разным ферментам, может быть хорошо обоснованно, но не менее обоснованными могут быть доказательства того, что эти оптимумы принадлежат одной транспортной системе, функционирующей в разных режимах. Есть мнение, что АТФазная система, работающая в плазматических мембранах растений, способна переключаться с одного режима работы на другой: I) электрогенный перенос Н+, 2) электрогенный К+/Н+ обмен, 3) неэлектрогенный К+/Н+ обмен при увеличении К+ в среде выше нормы, 4) К+/ ±обмен при недостатке К+ или в условиях засоления среды (Воробьев, 1980).

Предполагают, что НаК±АТФаза плазматических мембран животных клеток также может функционировать в нескольких режимах, при щелочных значениях рН, осуществляя обмен, при нейтральных рН иа+/к+ и при кислых значениях рН — Н+/К+ обмен (Болдырев, Г982). Известно, что на+, к+—АТБаза имеет два активных центра — один на внешней и другой на внутренней стороне мембраны. Внешний активный центр связывает ионы К+, а внутренний — ионы Na+(Skou, 1964). Показано, что сродство центров к ионам Na+ и К+ изменяется в зависимости от рН раствора. Повышение концентрации ионов водорода увеличивает сродство центров иа+, К±АТФ-азы к калию и уменьшает к натрию. Ионы ОН" повышают сродство к натрию и уменьшают к калию (Skou, Esmann, 1980). Поэтому, при низких значениях рН фермент может работать как К+, Н±Шаза, а цри высоких величинах рН — как Na+, Na+ -А1Ф-аза. Вероятно, натриевые и калиевые центры фермента представлены функциональными группами белка, способными к реакции протонирования и депротонирования (Ткачук, 1974), 0 наличии таких протон-донорных и протон-акцепторных групп в молекуле фермента свидетельствуют также данные об особенностях связывания оуабаина ферментом (Shuurmans Stekhoven, Bonting, 1981).

Очевидно, вопрос о переключении работы фермента с одного режима работы на другой имеет общие точки с вопросом о связи транспорта Н+ с работой яга+, К±насоса. 0 том, что такая связь имеется, свидетельствуют ряд фактов. При проведении возбуждения аксоном кальмара в омывающем растворе зарегистрировано увеличение концентрации ионов водорода. После прекращения раздражения рН принимало прежнюю величину (Вепринцев и др. 1972). Вепринцевым с соавторами (1972) установлено, что за один нервный импульс из аксоплазмы в наружную среду перено.

12 + 2 сится приблизительно 10 гр-ион Н /см. С помощью стеклянного миьфоэлектрода были измерены значения рН внутри нейрона улитки, в волокнах Пуркинье сердца овцы, в волокнах камбало-видной мышцы мыши. Оказалось, что во всех этих случаях внутриклеточное значение рН было на 0,1−0,3 ед. более щелочное, чем рН наружной среды, В нейроне улитки было зарегистрировано рН 7,5 против рН 7,4 в наружной среде, в волокнах Пур-кинье -7,4 против 7,2 и в волокнах камбаловидной мышцы -7,4 против 7,1 С Thomas, 1977), По мнению Томаса (Thomas, 1976) вероятен активный транспорт Н+ через возбудимую мембрану, так как значения рН внутри клетки слишком высоки, чтобы их можно было объяснить пассивным выходом протонов через клеточную мембрану.

Взаимосвязь выхода протона с активным транспортом Na+ и К+ показана в экспериментах на эпителиальных клетках подчелюстных желез крыс (Knouf «19 74), а также в экспериментах на нерве, устанавливающих факт частотной зависимости выхода протона из нерва (Максимов, 1977).

В работе Вепринцева с соавторами (1972) предлагается гипотетическая схема транспорта Н+ через аксональную мембрану, в котором принимает непосредственное участие ш +, К±АТФаза. п к н1 miia+i.

Е~пК+.

— Е: -Е" К.

АТЗ.

— Е ¦Е ' Е.

АДФГРН.

Na.

Рис. 39 Предполагаемая схема транспорта ионов в аксоне кальмара (Вепринцев и др., 1972).

На внутренней стороне мембраны АТФаза взаимодействует с АТФ. При этом низкоэнергетическая форма фермента (Е~), имеющая высокое сродство к ионам К" 1″, переходит в высокоэнергетическую форму (Е связывающую ионы Иа На внешней стороне мембраны в отсутствии АТФ Е ^ будет гидролизоваться и превратится в Е~. В результате гидролиза комплекса E~mNa+ распадается и ионы Na + освобождаются во внешний раствор. Гидролиз ма1фоэргических соединений, как известно, сопровождается освобождением Н+. Схема транспорта Н+, сопряженного с работой Na +, К±насоса, требует еще экспериментального подтверждения*.

Таким образом, как видно из рассмотренных фактов, предположение о том, что обнаруженные два пика АТвазной активности в плазматических мембранах клеток флоэмы борщевика могут быть режимами работы одной сложной транспортной системы, является не менее обоснованным, чем предположение о наличии в одной плазматической мембране двух разных АТФаз. Изучая степень активирования катионами К+ и Na+ АНазного препарата ми1фосомальной фракции, обогащенной плазматическими мембранами из корней галофита piantago maritima и менее солеустойчивого piantago coronopus Эрдеи и Куипер С Erdei, Kuiper, В80) предложили транспортную модель Н±насоса, состоящего из нескольких субъединиц, регулируемых гормонами липидами и двухвалентными катионами и участвующего в транспорте различных одновалентных катионов.