Клиническое и молекулярно-цитогенетическое исследование синдрома Вильямса

Актуальность темы

В структуре задержки психического развития (ЗПР) у детей синдром Вильямса (СВ) является одной из распространённых, нозологически самостоятельных форм умственной отсталости и по значимости занимает третье место после синдрома Дауна и фенилкетонурии [6]. Показано, что интеллектуальный дефект при СВ имеет уникальные особенности, облегчающие постановку клинического диагноза, с одной стороны, и создающие определённую почву для социальной реабилитации, с другой стороны [6, 77]. Кроме того, в симптомокомплекс этого заболевания входят пороки развития внутренних органов, причём наиболее распространённым является поражение сердца [77]. Характерным признаком этого заболевания считается изменение обмена кальция (гиперкальцемия), с которым связывают проблемы вскармливания в раннем возрасте [72, 6, 48, 77]. Описаны также особенности метаболизма витамина Б3 [42, 6, 48], что, предположительно, может играть роль как в патогенезе гиперкальцемии [42], так и в преждевременном половом созревании, отмечаемом при СВ [6].

В последнее время практикующие клиницисты и исследователи дополнительно выделяют и изучают такие проявления СВ, как задержка физического развития (начиная с интранатального периода) — патологические изменения строения костной и соединительной ткани (которые, предположительно, являются основой для формирования ряда пороков развития, в том числе ВПС, и микроаномалий) — снижение мышечного тонусаряд аномалий зрительного анализатора, в том числе нарушающие, вероятно, его функцииартериальная гипертензия, инсульты и некоторые другие. Изучение этих, казалось бы, второстепенных по отношению к умственной отсталости и порокам симптомов подводит к формированию концепции множественного поражения организма при СВ, на которой должен базироваться спектр лечебно-реабилитационных мероприятий. В частности, предлагаются различные меры по модификации вскармливания в раннем возрасте при наличии гиперкальцемии [42]- разными исследователями ведётся разработка тактики патогенетического и симптоматического лечения артериальной гипертензии [6, 130, 129] и принципов мониторирования параметров сердечно-сосудистой и мочевыделительной систем. Все эти мероприятия в конечном итоге способствуют социально-психологической реабилитации не только больного, но и его семьи.

Отдельной проблемой, которая, безусловно, включает и социальный аспект, является ранняя диагностика СВ у ребёнка (когда родители, а особенно мать, находятся в фертильном периоде онтогенеза), прогноз потомства и профилактика повторного рождения детей с СВ. Известно, что наличие интеллектуального дефекта при СВ часто маскируется характерным, относительно неплохим развитием речи [6, 77], поэтому особое значение для раннего выявления этого заболевания приобретают такие типичные симптомы, как врождённые пороки сердца (и особенно характерный для СВ надклапанный стеноз аорты), уникальный комплекс лицевых дисморфий (который полностью формируется к возрасту 4 лет [3]), идиопатическая гиперкальцемия раннего возраста. Сочетание этих признаков в различной комбинации с задержкой психомоторного развития требует диагностических мероприятий по исключению СВ.

До конца XX века диагноз синдрома Вильямса устанавливался исключительно по наличию специфических симптомов (клинических и биохимических). У таких больных кариотип, определяемый стандартными цитогенетическими методами, как правило, нормальный [77]. Последние несколько лет для подтверждения клинического диагноза успешно используется молекулярное и молекулярно-цитогенетическое исследование. Это стало возможным благодаря открытию и описанию района длинного плеча 7 хромосомы (7ц11.2), микроделеции которого, как уже доказано с помощью методов молекулярного и молекулярно-цитогенетического исследования, являются этиологической основой СВ [35, 71, 85, 101, 137]. В ряде стран мира проведение FISH со специфичными (для района 7qll.2) ДНК-зондами в последнее время рассматривается как диагностически ценное и обязательное мероприятие для диагностики СВ [55, 20, 77]. В то же время, по данным разных исследователей, существует явление неоднородности мутаций (как правило, делеций) в пределах критического района, что может осложнять как выбор ДНК-зонда для молекулярно-цитогенетического обследования, так и интерпретацию результатов для конкретного больного. Данные о частоте СВ среди детей Санкт-Петербурга при изучении литературы не найдены, а методы диагностики в настоящее время ограничены лишь клинико-инструментальными исследованиями. Молекулярно-цитогенетическая диагностика этого синдрома в Санкт-Петербурге не проводится в связи с отсутствием материальной базы. Таким образом, изучаемая проблема актуальна для медицинской генетики.

Цель исследования: на основании комплексного — клинического и молекулярно-цитогенетического — подхода изучить СВ у детей и обосновать рекомендации по улучшению диагностики данного заболевания.

Задачи исследования:

1. Изучить клиническую картину у больных с СВ: выявить характерные симптомы заболевания и дополнительные особенности.

2. На основе предоставленных продуктов первичной амплификации искусственных дрожжевых хромосом создать в лабораторных условиях ДНК-зонды, пригодные для проведения молекулярно-цитогенетическое исследованияпроизвести оценку специфичности и чувствительности полученных ДНК-зондов, осуществив молекулярно-цитогенетическое исследование на контрольном материале (хромосомных препаратах, полученных от лиц без клинической симптоматики СВ).

3. Провести молекулярно-цитогенетическое исследование на хромосомных препаратах, полученных от больных с СВ, с применением созданных ДНК-зондов.

4. Сопоставить данные клинического исследования с данными молекулярноцитогенетического исследования при СВ.

Научная новизна.

Впервые в России показано, что для подтверждения клинического диагноза синдрома Вильямса можно и нужно использовать высокоточного современного метода FISH с несколькими локус-специфичными ДНК-зондами, целиком перекрывающими критический для СВ район 7 хромосомы (7ql 1.2). Выявлены варианты делеций: STS-маркера D7S489B, STS-маркера D7S672 и одновременно обоих STS-маркеров: D7S489B и D7S672.

Впервые описан феномен делеции в прицентромерной области 7р 11.1−7pl 1.2 (STS-маркера D7S494) за пределами критического для СВ района 7ql 1.2 при наличии делеции STS-маркера D7S489B в районе 7ql 1.2.

Впервые обнаружено сочетание гемизиготных делеций одновременно по двум STS-маркерам (D7S489B/D7S672 и D7S489B/D7S494) при дизиготном состоянии других локусов (D7S494 и D7S672 соответственно).

Впервые проведено сопоставление типичных клинических проявлений СВ с делециями в области STS-маркеров: D7S489B (7qll.2), D7S672 (7ql 1.2), D7S494 (7pl 1 .l-7pl 1.2) у больных с СВ, не являющихся родственниками. Впервые сопоставлены дополнительно выявленные аномалии и особенности фенотипа у больных с СВ, не являющихся родственниками, и делеции в области STS-маркеров: D7S489B (7qll.2), D7S672 (7qll.2), D7S494 (7pll.l-7pl 1.2). Впервые установлено сочетание поздней гиперкальцемии с одновременной делецией двух STS-локусов D7S489B (7ql 1.2) и D7S494 (7р11.1−7р11.2). Впервые выявлена гипокальцемия при синдроме Вильямса при различных вариантах делеций исследованных STS-маркеров. Впервые установлена артериальная гипотензия (в сочетании с анамнестической гиперкальцемией) при наличии гемизиготных делеций в двух STS-локусах: D7S489B (7ql 1.2) и D7S494 (7pl 1.1−7р11.2).

Практическая значимость. Проведённое исследование показало индивидуальную вариабельность типичных симптомов заболевания, возможное наличие нетипичных врождённых пороков, микроаномалий и функциональных особенностей, что должно учитываться при клинической диагностике и диспансерном наблюдении этих больных.

Продемонстрирована адекватность и необходимость применения молекулярно-цитогенетического исследования критического района 7 хромосомы (7qll.2) с помощью ДНК-зондов 743 g06 и 893 Ь12 (БТЗ-маркеры Э78 489 В и Т)1§-612 соответственно) для верификации клинического диагноза СВ. Показана обязательность применения набора ДНК-зондов, целиком перекрывающего район делеции, в связи с выявленной вариабельностью молекулярного дефекта.

Полученные данные могут быть использованы для разработки практических рекомендаций по улучшению диагностики данного заболевания. В настоящей работе предложен ряд практических рекомендаций по первичному обследованию и диспансерному наблюдению больных детей.

Впервые установленный феномен делеции БТБ-маркера Э78 494 в прицентромерной области 7р11.1−7р11.2 при наличии микроделеции в районе 7qll.2 может быть использован для дальнейшего изучения механизма возникновения микроделеции в критическом для СВ районе и разработки концепции медико-генетического консультирования семей с пробандами, страдающими СВ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Клинической картине синдрома Вильямса присуща индивидуальная вариабельность типичных симптомов. Характерный фенотип может включать дополнительные врождённые пороки, микроаномалии и функциональные особенности.

2. Уровни специфичности и чувствительности созданных ДНК-зондов являются достаточными для выявления делеции соответствующих STS-маркеров.

3. Молекулярно-цитогенетический метод исследования (флюоресцентная гибридизация in situ, на хромосомных препаратах) является основным и необходимым лабораторным способом подтверждения клинического диагноза синдрома Вильямса. Хромосомная микроделеция в критическом районе длинного плеча 7 хромосомь1 имеет варьирующую протяжённость. В некоторых случаях при синдроме Вильямса обнаруживается дополнительная делеция за пределами критического района, в прицентромерной области короткого плеча 7 хромосомы.

4. Выявленные варианты изменения структуры 7 хромосомы не имеют специфических клинических проявлений.

Апробация работы. Результаты клинического и молекулярно-цитогенетического исследования были представлены на конференции «Лабораторная медицина — взгляд в будущее» (2001), материалы диссертации обсуждались на заседании кафедры медицинской генетики Государственного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования (ГОУ ДПО) «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (2002), были представлены на Международной конференции «Врачи мира — пациентам» (2003), семинарах Государственного учреждения «Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук» (2004, 2006).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объём и структура работы. Объём и структура работы: Диссертационная работа изложена на 174 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», трёх глав,.

ВЫВОДЫ.

1. Типичные клинические проявления синдрома Вильямса характеризуются индивидуальной вариабельностью по числу лицевых дисморфий и признаков патологии костной и соединительной ткани, вариантам аномалий сердечнососудистой системы. В отдельных случаях характерный фенотип СВ может включать нетипичные врождённые пороки, микроаномалии и особенности, в том числе артериальную гипотензию, гипокальцемию.

2.Уровни специфичности и чувствительности использованных при молекулярно-цитогенетическом исследовании ДНК-зондов являются достаточными для выявления делеции соответствующих ЗТБ-маркеров (расположенных в пределах сайтов гибридизации конкретных ДНК-зондов).

3. Молекулярно-цитогенетический метод исследования (флюоресцентная гибридизация ДНК-зондов на хромосомных препаратах) является ценным и необходимым способом верификации клинического диагноза синдрома Вильямса. У всех больных в исследованной группе с высокой степенью достоверности (р<0,05) установлено наличие делеции в районе 7 хромосомы, ответственном за развитие клинической картины СВ. Протяжённость микроделеции в критическом районе 7 хромосомы имеет индивидуальную вариабельность.

4. Типичная микроделеция в критическом районе в некоторых случаях сочетается с делецией в области локализации БТБ-маркера Э78 494 в коротком плече 7 хромосомы, за пределами района 7 хромосомы, ответственного за развитие клинической картины СВ.

5. Фенотипических проявлений, строго специфичных для выявленных вариантов изменения структуры 7 хромосомы, установить не удалось.

Практические рекомендации.

Данные проведённого исследования свидетельствуют в пользу правомочности концепции множественного поражения организма при синдроме Вильямса и подтверждают представление об этом заболевании как о фенотипическом проявлении хромосомной микроделеции. Предлагаем следующий комплекс мероприятия при первичном обследовании больного ребёнка с клинической картиной синдрома Вильямса:

1. кариотипирование;

2. молекулярно-цитогенетическое исследование района 7 хромосомы, ответственного за синдром Вильямса;

3. эхографическое исследование сердцаприменение рентгеноконтрастного метода — по показаниямконтроль артериального давления (независимо от возраста) — консультация кардиолога/кардиохирурга;

4. консультация невропатолога при выявлении патологических изменений, инструментальное обследование — по показаниям;

5. консультация психоневролога (невропатолога) для выявления типичного интеллектуального «профиля» и особенностей координации движений;

6. определение уровня кальция и параметров липидного обмена (холестерин, Р-липопротеиды) в крови независимо от возраста пациента;

7. эхографическое исследование внутренних органов;

8. консультация эндокринолога, обследование — по показаниям;

9. консультация ортопеда;

10.консультация офтальмолога с оценкой функции цветового зрения;

11. консультация гастроэнтеролога;

12.консультация генетика.

Предлагаем комплекс мероприятий при диспансерном наблюдении больных с синдромом Вильямса:

1. контроль артериального давления при плановых осмотрах педиатра, а также при наличии интеркуррентных заболеваний;

2. при выявлении повышения артериального давления — консультация кардиологапо показаниям — мониторинг артериального давления, подбор корректирующей терапии;

3. повторное эхографическое исследование сердца (по назначению кардиолога/кардиохирурга), внутренних органов (включая почки) — при выявлении патологических изменений — консультация специалиста соответствующего профиля;

4. наблюдение невропатолога;

5. наблюдение психоневролога и разработка индивидуальных мероприятий по социальной реабилитации больного с учётом совокупности и степени выраженности характерных для СВ и индивидуальных особенностей пациента;

6. наблюдение офтальмолога;

7. при наличии патологии опорно-двигательного аппарата — наблюдение специалиста, коррекционные мероприятия — по показаниям;

8. наблюдение гастроэнтеролога, подбор корректирующей терапии при моторной дисфункции ЖКТ.

Учитывая данные проведённого исследования, представляется целесообразным обследование членов ядерной семьи на этапе медико-генетического консультирования, что может послужить также предметом для дальнейшего исследования:

1. кариотипирование и молекулярно-цитогенетическое обследование всех членов ядерной семьи;

2. эхографическое исследование сердца и внутренних органов (включая почки) для всех членов ядерной семьи;

3. оценка особенностей интеллекта у всех членов ядерной семьи специалистами соответствующего профиля;

4. клинико-морфологический осмотр клиническим генетиком всех членов ядерной семьи;

5. медико-генетическое консультирование семьи.