Дипломы, курсовые, рефераты, контрольные...
Срочная помощь в учёбе

Количественное определение вируса гепатита C методом ПЦР в реальном времени и его генотипирование с использованием флуорогенных бинарных зондов

Диссертация: Количественное определение вируса гепатита C методом ПЦР в реальном времени и его генотипирование с использованием флуорогенных бинарных зондов
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Разработке подхода для создания генотип-специфичных зондов. Зонды с новым дизайном, названные бинарными, структурно и функционально отличаются от линейных зондов и состоят из 5'- и 3'-сегментов, соединенных линкером. Более длинный 3'-сегмент обеспечивает посадку зонда на матрицу до гибридизации праймеров, более короткий 5'-сегмент, содержащий флуорофор и гаситель, обеспечивает специфичность зонда… Читать ещё >

Содержание

  • Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 1. 1. Строение вируса гепатита С
    • 1. 2. Жизненный цикл ВГС
    • 1. 3. Вариабельность генома ВГС и его генотипы
    • 1. 4. Алгоритмы диагностики и лечения вирусного гепатита С
    • 1. 5. Полимеразная цепная реакция с регистрацией продуктов амплификации в режиме реального времени (ПЦР-РВ)
    • 1. 6. ПЦР в режиме реального времени и схемы флуоресцентной детекции
    • 1. 7. Методы анализа графиков накопления ДНК
      • 1. 7. 1. Алгоритмы сглаживания
      • 1. 7. 2. Вычитание фоновой составляющей
      • 1. 7. 3. Определение значения Сц
      • 1. 7. 4. Пороговый метод сравнения графиков накопления ДНК (О-)
      • 1. 7. 5. Метод максимума второй производной — нахождение Сц по форме кривой
      • 1. 7. 6. Методы оценки эффективности амплификации
      • 1. 7. 7. Метод серийных разведений
      • 1. 7. 8. Определение Е по приросту флуоресценции в экспоненциальной фазе
      • 1. 7. 9. Аппроксимация сигмоидой или логистической функцией
      • 1. 7. 10. Оценка эффективности амплификации в экспоненциальной фазе с использованием сложных моделей
      • 1. 7. 11. Обсуждение методов определения Сц и Е
    • 1. 8. Общий дизайн количественного ПЦР-исследования с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени
    • 1. 9. Общие рабочие характеристики тестов для выявления и количественного определения РНК ВГС
    • 1. 10. Генотипирование ВГС

Количественное определение вируса гепатита C методом ПЦР в реальном времени и его генотипирование с использованием флуорогенных бинарных зондов (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Актуальность проблемы.

Несмотря на значительные усилия, предпринимаемые в течение многих лет службами здравоохранения большинства государств по предотвращению распространения гепатита С (ГС), эта инфекция и в настоящее время является актуальной мировой проблемой. По данным экспертов на земном шаре насчитывается более 500 млн. человек, инфицированных вирусом гепатита С (ВГС), в Российской Федерации их число приближается к 5 млн. Количество новых случаев заболевания ГС, регистрируемых в США, ежегодно достигает около 175 тыс., в Западной Европе — 170 тыс., в Японии — более 350 тыс. Только в США каждый год умирает около 10 тыс. человек, инфицированных ВГС [149- 216]. Ситуацию в значительной мере осложняют отсутствие вакцины против ГС, циркуляция большого количества разных генотипов вируса, способность его к ускользанию от иммунного контроля человека за счет непрерывного обновления антигенной структуры, а также высокая частота протекания инфекции в скрытой бессимптомной форме. Поэтому актуальными задачами для здравоохранения всех стран являются: профилактические меры по снижению риска заражения ВГС здорового населения, повышение эффективности выявления инфицированных лиц и проведение действенной противовирусной терапии.

Для диагностики гепатита С в настоящее время применяется комплекс методов, включающих определение в сыворотке крови обследуемых людей антител к вирусным антигенам с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) и иммуноблота, а также обнаружение вирусной РНК ВГС с использованием технологий амплификационного тестирования нуклеиновых кислот (NAT) [14]. Одним из широко распространенных NAT-методов является полимеразная цепная реакция (ПЦР) с флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени (ПЦР-РВ), благодаря простоте исполнения, высокой чувствительности, специфичности и надежной интерпретации результатов анализа. Высокая чувствительность этого метода особенно актуальна в трансфузиологии для обеспечения учреждений здравоохранения безопасной донорской кровью и ее компонентами, поскольку он (метод) позволяет выявлять нуклеиновую кислоту ВИЧ и вирусных гепатитов В (ВГВ) и С (ВГС) в ИФА-отрицательных пробах крови [44], полученных в период сероконверсионного окна [6]. Применение ПЦР в службе крови в США, Канаде, Великобритании, Франции и ряде других стран уже привело к снижению риска трансфузионной передачи ВГС в 6 раз [113]. В настоящее время ПЦР-тестирование активно внедряется в донорскую службу нашей страны. Согласно приказу Минздрава N 364 «Об утверждении Порядка медицинского обследования донора крови и ее компонентов» РФ от 14.09.2001 в редакции от 06.06.2008 «образцы крови с отрицательными результатами ИФА-тестов, объединенные в минипулы, должны подвергаться исследованию на наличие нуклеиновых кислот ВГВ, ВГС и ВИЧ» [222].

Комплексное применение методов ИФА и ПЦР позволяет не только значительно повысить эффективность диагностики гепатита С, но также более точно дифференцировать стадии заболевания и определять репликационную активность вируса в организме больного.

Количественные тесты для определения вирусной нагрузки незаменимы при принятии решения о проведении противовирусной терапии, а также определить перинатальное заражение ребенка от матери инфицированной ВГС.

Сопоставление результатов количественного анализа РНК ВГС, полученных с использованием ЫАТ-тестов различных производителей, стало возможным после разработки и сертификации Национальным институтом биологических стандартов и контролей совместно с Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) унифицированного стандарта для измерения РНК ВГС в международных единицах (МБ) [153].

Эффективность противовирусной терапии гепатита С, как установлено в результате многочисленных исследований [154- 156- 157], зависит от генотипа вируса, которым инфицирован больной. Генотип во многих случаях определяет продолжительность терапии и дозу препаратов, именно поэтому наряду с количественным анализом необходимо проводить генотипирование ВГС [217].

Таким образом, для комплексной ПЦР-диагностики ВГС необходимы тесты для выявления, количественного определения и генотипирования ВГС.

В настоящее время не разработаны нормативные документы, содержащие перечень требований, предъявляемых к диагностическим тестам с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени для диагностики ВГС [5]. Тем не менее, при разработке т-Иоше тестов для диагностики ГС можно ориентироваться на параметры наборов реагентов зарубежных аналогов, прошедших широкие клинические испытания.

Представленные на Российском рынке тесты для ПЦР-диагностики ВГС уступают по чувствительности зарубежным аналогам, а также не лишены недостатков в дизайне.

Представленные на отечественном рынке импортные диагностические тесты ведущих мировых производителей ограниченно доступны вследствие высокой стоимости. Поэтому для существенного улучшения ситуации с диагностикой ВГС в России актуальна разработка и внедрение новых отечественных диагностических наборов.

Цель исследования.

Целью настоящего исследования является разработка, валидация и апробация наборов реагентов для количественного определения и дифференциации генотипов 1, 2, 3 вируса гепатита С на основе ПЦР в реальном времени.

Задачи исследования.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. подобрать специфические праймеры и зонды для выявления РНК ВГСвыполнить оптимизацию условий проведения ОТ-ПЦР в режиме реального временисовместить этапы обратной транскрипции и ПЦР;

2. провести оптимизацию методики проведения количественного анализа путем разработки алгоритмов обработки исходных флуоресцентных данных.

3. разработать композицию праймеров и генотип-специфичных флуорогенных зондов, обеспечивающую максимальную специфичность и позволяющую в одной пробирке одновременно выявлять генотипы 1, 2 и 3 ВГСпровести оптимизацию условий проведения ОТ-ПЦР в режиме реального времени;

4. на основе проведенных исследований разработать диагностические наборы для выявления РНК и генотипирования ВГСопределить их основные аналитические и диагностические характеристикипровести апробацию.

Научная новизна.

В рамках разработки процедуры проведения количественного анализа предложен алгоритм устранения разрывов/выбросов в графиках флуоресцентных кривых с последующей обработкой фильтром высокочастотного шума. Такой алгоритм позволяет значительно повысить точность анализа при наличии в флуоресцентных кривых скачков и разрывов.

Предложен оригинальный алгоритм введения поправки на внутренний контрольный образец (ВКО) для учета потерь РЖ в процессе пробоподготовки, суть которой заключается в смещении значения Сс/ ВГС на, А Сд ВКО относительно среднего Cq ВКО по всей постановке.

При достигнутой воспроизводимости анализа (80<0,3 1о§ ю (конц., МЕ/мл) и линейности (с эффективностью амплификации около 100% во всем диапазоне определяемых концентраций) предложен метод определения вирусной нагрузки с одним образцом сравнения, что позволило повысить производительность теста.

Предложен оригинальный подход к дизайну генотип-специфичных зондов. Зонды с новым дизайном, названные бинарными, позволяют дифференцировать последовательности, содержащие одиночные замены. Основными преимуществами бинарных зондов является высокая специфичность и возможность типирования мононуклеотидного полиморфизма, расположенного в пределах непротяженного консервативного участка 10−12 нуклеотидов (по сути, альтернатива коротким зондам с дорогостоящими модификациями, повышающими Тш, такими как ЬЫА, МСВ [162]).

Практическая значимость.

1. Разработанный подход для выявления и количественного определения РНК вируса гепатита С в сыворотке (плазме) крови с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени лег в основу коммерчески доступного набора реагентов «РеалБест РНК ВГС», выпускаемого ЗАО «Вектор-Бест» и прошедшего государственную регистрацию. Разработанный тест может использоваться как для высокочувствительного скринирования донорской крови, так и в клинической практике для:

• подтверждения диагноза гепатит С,.

• ведения больных с хроническим гепатитом С,.

• определения активности ВГС-инфекции, принятия решения о начале терапии,.

• прогнозирования исхода терапии и необходимости ее продолжения,.

• определения вирусологического ответа на противовирусную терапию.

2. Разработан подход к дизайну бинарных генотип-специфичных зондов, позволяющих типировать мононуклеотидный полиморфизм, в пределах непротяженного консервативного участка 10−12 нуклеотидов.

3. Разработанный набор для дифференциации генотипов 1, 2 и 3 с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени лег в основу коммерчески доступных наборов реагентов «РеалБест РНК ВГС-½/3» и «РеалБест РНК ВГС-генотип», выпускаемых ЗАО «Вектор-Бест» и прошедших государственную регистрацию.

4. Разработанный набор «РеалБест РНК ВГС-генотип» для комплексной ПЦР-диагностики ВГС включает реакционную смесь для выявления, количественного определения РНК и реакционную смесь для генотипирования ВГС. Набор с такой комплектацией удобен для применения в клинической практике на этапе обследования пациентов до начала проведения противовирусной терапии для комплексной ПЦР-диагностики ВГС.

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработанный алгоритм проведения количественного анализа, позволяет достигнуть высокой воспроизводимости результатов анализа за счет предложенной системы обработки исходных флуоресцентных данных и процедуры определения вирусной нагрузки с возможностью учета потерь НК в процессе пробоподготовки, а также эффективности амплификации.

2. Зонды с оригинальным дизайном, названные бинарными, позволяют дифференцировать последовательности, содержащие одиночные замены.

3. Набор реагентов «РеалБест РНК ВГС» обладает следующими характеристиками:

— аналитическая чувствительность 15 МЕ/мл.

— аналитическая специфичность -100%.

— линейный диапазон измеряемых концентраций -10—10 МЕ/мл.

— сходимость (прецизионность) — коэффициент вариации количественных оценок в логарифмических единицах варьировал от 0,5 до 3,5% при концентрациях вирусной РНК 104−107МЕ/мл и от 2,5 до 12% при концентрациях вирусной РНК 102−103 МЕ/мл.

4. Набор реагентов «РеалБест РНК ВГС ½/3» обладает следующими характеристиками:

— аналитическая чувствительность — 400 МЕ/мланалитическая специфичность -100%. Апробация работы и публикации.

На основе разработок, проведенных в ходе настоящего исследования налажено серийное производство наборов на базе ЗАО «Вектор-Бест». Для наборов «РеалБест РНК ВГС», «РеалБест РНК ВГС-½/3» и «РеалБест РЖ ВГС-генотип» получены государственные регистрационные удостоверения № ФСР 2008/2 288, № ФСР 2010/9 021 и № ФСР 2010/9 022, соответственно. По результатам исследований опубликовано 4 работы в научных журналах, 3 из которых входят в перечень ВАК. Работа была представлена на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов в 2008 г. в Новосибирске и на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров в 2009 г. в Москве, а также доложена на отчетной сессии Института цитологии и генетики СО РАН в 2009 г.

ВЫВОДЫ.

1. Для выявления и количественного определения РНК ВГС подобраны специфические праймеры и. зонды в пределах района 5'-UTR, совмещены этапы обратной транскрипции и ПЦРразработан подход дляобработки исходных флуоресцентных данных, обеспечивающий высокую устойчивость алгоритма определения значения Cq к скачкам и разрывам в флуоресцентных кривых, а также оптимизирована процедура проведения количественного анализа с одним образцом сравнения.

2., Разработан диагностический набор «РеалБест РНК ВГС» со следующими характеристиками: аналитическая чувствительность 15 МЕ/мланалитическая специфичность 100%- линейный диапазон измеряемых.

О 7 концентраций 10—10 МЕ/млкоэффициент вариации количественных оценок от 0,5 до 3,5% при концентрациях вирусной РНК 104−107МЕ/мл и от 2,5 до 12%.

2 3 при концентрациях вирусной РНК 10−10 МЕ/мл. Коэффициент корреляции количественных оценок разработанного теста с наборами «Abbott RealTime™ HCV» и «ОТ-Гепатоген-С количественный» составляет 0,96 и 0,9, соответственно.

3. Предложен оригинальный подход к дизайну генотип-специфичных бинарных зондов, позволяющих дифференцировать однонуклеотидные замены в пределах консервативного участка 10−12 нуклеотидов.

4. Подобраны генотип-специфичные флуорогенные зонды, обеспечивающие максимальную специфичность и позволяющие в одной пробирке одновременно выявлять генотипы 1, 2 и 3 ВГСпроведена, оптимизация условий ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Разработан диагностический набор «РеалБест РНК ВГС-½/3» с аналитической чувствительностью 400 МЕ/млдиагностической чувствительностью 100%- аналитической и диагностической, специфичностью 100%.

5. При сравнительном анализе 200 пациентов с моноинфекцией ВГС и 187 коинфицированных ВИЧ/ВГС установлено, что 9% коинфицированных содержат РНК ВГС, но отрицательны по ИФА на анти-ВГС, чего не наблюдается у пациентов только с ВГС. У больных с моноинфекцией ВГС преобладает генотип 3, у ВИЧ-инфицированных с коинфекцией ВГС генотипы 1 и 3 присутствуют в равном соотношении.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Для комплексной ПЦР-диагностики ВГС необходимы тесты для выявления, количественного определения и генотипирования ВГС.

Основным результатом настоящей работы является разработка наборов реагентов на основе ПЦР-РВ для комплексной диагностики ВГС: выявления, количественного определения и генотипирования.

В ходе работ по созданию теста для выявления и количественного определения РНК ВГС особое внимание было уделено:

1. Тщательному подбору праймеров и зондов, в большей степени определяющих специфичность анализа. На основании множественного выравнивания для дизайна композиции праймеров и зонда был выбран 5'-иТЯ, как наиболее консервативный участок.

2. Оптимизации состава реакционной смеси. Совмещение этапов-обратной транскрипции и ПЦР было осуществлено за счет подбора буфера, соотношения трегалозы и бетаина, добавления в реакционную смесь БСА для стабилизации ферментов и антител к активному центру Тая-полимеразы, обеспечивающих горячий старт. Для приготовления готовых реакционных смесей (ГРС) была использована технология лиофильного высушивания, обеспечивающая высокую стабильность при транспортировке и хранении.

3. Разработке алгоритма обработки исходных флуоресцентных данных. В программном обеспечении «РеалБест-диагностика» реализован предложенный нами алгоритм устранения разрывов/выбросов в графиках флуоресцентных кривых и обработки с помощью фильтра высокочастотного шума с последующим нахождением максимума второй производной (БОМ) путем аппроксимации девяти значений положительного пика полиномиальной функцией. Значение ЭОМ используется в качестве характеристической точки (Сд), описывающей флуоресцентную кривую. Предложенный алгоритм позволяет значительно повысить точность анализа при наличии в флуоресцентных кривых скачков и разрывов.

4. Разработке экзогенного внутреннего контрольного образца. В систему выявления! РНК ВГС был введен неконкурентный ВКО для контролирования этапов пробоподготовки и амплификации. Отсутствие конкуренции стандарта и целевой реакции было достигнуто за счет дизайна последовательности ВКО, заключающегося в пошаговом подборе олигонуклеотидов, не влияющих на амплификацию ВГС, с последующим их использованием для конструирования последовательности контроля. Для приготовления стабильного препарата ВКО была применена технология защищенной РНК.

5. Разработке алгоритма количественного определения РНК ВГС. В программном обеспечении «РеалБест-диагностика» для нахождения концентрации анализируемого образца реализован подход с использованием одного образца сравнения в каждой постановке. Эффективность амплификации предложено определять в одной «валидационной» постановке для серии набора реагентов с использованием калибровочных образцов. Такой подход позволил значительно сократить количество контрольных точек в индивидуальной постановке (3 ПКО, 1 ОКО), что позволило снизить себестоимость анализа. Для учета возможных потерь НК в процессе пробоподготовки нами был разработан оригинальный подход введения поправки на ВКО, суть которой заключается в смещении значения Cq ВГС на, А Сц ВКО относительно среднего по всей постановке. Такая поправка корректна только для сдвигов, вызванных потерей НК в процессе пробоподготовки, а не влиянием ингибиторов. Для подтверждения возможности использования такой поправки в серии экспериментов с двумя ВКО (ЦРА-ВКО и ВКО-И) было показано что система «РеалБест НК экстракция 100"/ «РеалБест РНК ВГС» не ингибируется веществами, содержащимися в препаратах НК, выделенных из сывороток и плазм с различными физическими свойствами.

6. Валидации (определению характеристик набора реагентов). Характеристики набора «РеалБест РНК ВГС» определяли с использованием контролных образцов (СОН, СОШЬ, СОП2а, СОПЗа), охарактеризованных относительно международного стандарта WHO Second InternationalStandard-for Hepatitis С virus RNA for Genomic Amplification Technology Assay, NIB SC 96/798. Аналитическую чувствительность определяли путем анализа, серии разведений СОП, приготовленных на ВГС-отрицательной ЭДТА-плазме или сыворотке человека. По результатам пробит-анализа чувствительность.

2 7 составила 15 ME/мл. Линейный диапазон составил 10−10' ME/мл с отклонением от теоретических значений не более 0,2 log10. Коэффициент вариации количественных оценок как внутри индивидуальной постановки, так и между различными постановками, в логорифмических единицах варьировал от 0,5 до 3,5% при концентрациях вирусной РНК 104−107МЕ/мл и от 2,5 до 12%.

3 2 при концентрациях вирусной РНК 10−10 ME/мл. Специфичность анализа на выборке отрицательных сывороток и ЭДТА-плазм составила 100%. На серии разведений СОШЬ, СОП2а, СОПЗа было показано, что наиболее распространенные в РФ генотипы выявляются с равной эффективностью. Количественные оценки, полученные с использованием «РеалБест РНК ВГС» хорошо согласуются с референсным набором Abbott RealTime™ HCV и набором ОТ-Гепатоген-С количественный (коэффициент корреляции 0,96 и 0,9, соответственно) и в меньшей степени согласуются с АмплиСенс HCV-Монитор-FRT (коэффициент корреляции 0,663).

В ходе работ по созданию теста для выявления РНК и генотипирования ВГС особое внимание было уделено:

1. Разработке подхода для создания генотип-специфичных зондов. Зонды с новым дизайном, названные бинарными, структурно и функционально отличаются от линейных зондов и состоят из 5'- и 3'-сегментов, соединенных линкером. Более длинный 3'-сегмент обеспечивает посадку зонда на матрицу до гибридизации праймеров, более короткий 5'-сегмент, содержащий флуорофор и гаситель, обеспечивает специфичность зонда (в участке его гибридизации содержится типируемый полиморфизм) — Основными преимуществами бинарных зондов является высокая специфичность и возможность типирования мононуклеотидного полиморфизма, расположенного в пределах непротяженного консервативного участка 10−12 нуклеотидов (по сути, альтернатива коротким зондам с дорогостоящими модификациями, повышающими Тш, такими как LNA, MGB). Принцип функционирования бинарного зонда был подтвержден in sil ico с использованием программного обеспечения UNA-Fold, которые заключались в моделировании дуплексов, образуемых зондом с различными генотипами, а также в экспериментах по плавлению бинарного зонда с олигонуклеотидами, соответствующими участку посадки всего зонда и составляющих его сегментов.

2. Подбору зондов для выявления генотипов 1, 2, 3 ВГС. За основу системы генотипирования была взята реакционная смесь «РеалБест РНК BFC». Подбор зондов осуществляли в пределах ампликона, ограниченного праймерами F и R, зонд Z4C использовали в качестве контроля для оценки эффективности расщепления генотип-специфичных зондов. На каждый генотип было подобрано 4−5 стандартных и бинарных зондов. Основные критерии, по которым проводили подбор зондов: специфичность детекции, амплитуда флуоресцентного сигнала, значение цикла для количественных оценок и расположение в пределах выбранного района. В результате были подобраны зонды для выявления генотипов 1, 2 и 3, так расположенные в пределах ампликона F-R, что можно их использовать одновременно в одной реакции (каждый генотип регистрируется в отдельном канале регистрирующего амплификатора). Подобранные зонды обеспечивают высокую специфичность генотипирования (отсутствуют перекрестные реакции между генотипами). Зонд для выявления генотипа 1 уникален тем, что дискриминация генотипов 2, 3, 4, 5 достигается за счет мисматчей, расположенных в участке посадки 5'-сегмента, а генотипа 6 за счет инсерций в участке гибридизации 3'-сегмента (в остальных бинарных зондах специфичность определяется только 5'-сегментом).

3. Выявлению изолятовимеющих мисматчи-в участках гибридизации генотип-специфичных зондов. В ходе работ по поиску мутантных изолятов, была установлена нуклеотидная последовательность 5'-UTR 188 геновариантов, циркулирующих на территории Западной Сибири. Из штаммов, имеющих мисматчи в участках посадки генотип-специфичных зондов, была собрана база, которая использовалась для проверки влияния мисматчей на амплитуду прироста флуоресценции и значение Cq при проведении генотипирования. В базу вошли штаммы субтипа За, имеющие мононуклеотидные полиморфизмы, не встречающиеся в Los Alamos HCV Sequence Database. С учетом именно этих штаммов для выявления генотипа 3 ВГС было подобрано 2 зонда на различные районы 5'-UTR. В результате для генотипов 1, 2, 3 было показано, что наличие мисматчей не приводит к значительному увеличению значения Cq и снижению амплитуды флуоресцентного сигнала.

4. Определению аналитических характеристик и апробации. Аналитическая чувствительность генотипирования составила 400 ME/мл. Для апробации системы генотипирования было использовано 188 образцов сыворотки крови инфицированных ВГС пациентов, из Сибирского региона, вирусная нагрузка у которых, определенная с помощью «РеалБест РНК ВГС», варьировала в диапазоне 10—10 ME/мл. В результате анализа ВГС генотипа 1 был выявлен в 45% (п=85) проб, генотипа 2 — в 6% (n=l 1), генотипа 3 — в 49% (n=92), а 4−6 генотипы не были обнаружены. При исследовании сывороток этой выборки с использованием референсного метода — прямого секвенирования 5'-UTR области РНК ВГС с последующим филогенетическим анализом — дискордантных результатов получено не было, что подтвердило высокую специфичность разработанной системы генотипирования (100%). В рамках проведения расширенных клинических испытаний набора реагентов «РеалБест.

РНК ВГС-генотип" было проанализировано 885 клинических образцов (440 сывороток и 445 ЭДТА-плазм), предоставленных «Новосибирским центром крови», «Станцией переливания крови» г. Рубцовск и «Томской областной станцией переливаниякрови». В результате анализа, ВГС генотипа 1 был выявлен в 39% проб, генотипа 2 — в 7%, генотипа 3 — в 52% и микст инфекция 1+3 в 2%, т. е. выявлено преобладание генотипа 3. Полученные данные согласуются с исследованиями по распределению генотипов в Томской области, где также показано преобладание генотипа 3.

В рамках апробации «РеалБест РНК ВГС» и «РеалБест РНК ВГС-½/3» было проведено обследование ВИЧ-инфицированных с коинфекцией ВГС. Оказалось, что среди ВИЧ-инфицированных 43,5% коинфицированы ВГС- 9% ВИЧ-инфицированных, у которых выявляется РНК ВГС, отрицательны по ИФА на анти-ВГС. Эти данные указывает на необходимость ранней ПЦР-диагностики ВГС у ВИЧ-инфицированных. Для всех образцов, положительных по «РеалБест РНК ВГС», удалось определить генотип, таким образом, диагностическая чувствительность «РеалБест РНК ВГС-½/3» составила 100%. Было показано, что в выборке больных с моноинфекцией ВГС преобладает генотип 3, тогда как у ВИЧ-инфицированных с коинфекцией ВГС генотипы 1 и 3 присутствуют в равном соотношении.

В результате настоящей работы были разработаны, наборы для-комплексной ПЦР-диагностики ГС с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени: набора для выявления и количественного определения вирусной РНК и набора для дифференциации генотипов 1, 2, 3. Предложен вариант набора для комплексной диагностики ВГС — «РеалБест РНК ВГС-генотип», который укомплектован реакционной смесью для выявления и количественного определения РНК ВГС, соответствующей ГРС.

Показать весь текст

Список литературы

  1. A.F. Стехиометрия минорных последовательностей- и гетероплазмия митохондриального. генома Beta Vulgaris: дис.. канд. биологических наук. Новосибирск., 2010. 145с.
  2. Генотипирование вируса гепетита С при помощи ПЦР-РВ с использованием 5'-гидролизуемых зондов с олигодезоксиинозиновыми линкерами / В. Е. Ведерников и др. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2009. Т. 4. С. 32 38.
  3. O.A. Внутренний стандарт для конкурентной полимеразной цепной реакции на основе ретровирусного вектора: дис.. канд. биологических наук. М., 2004. 96 с.
  4. A.A., Федоров H.A. и Суханов Ю.С. Критерии для отбора систем генотестирования, используемых при контроле вирусной безопасности крови и ее продуктов // Вестн. службы крови России. 1998. № 1. С. 18−20.
  5. Е.Б., Федоров H.A., Рейзман П.В. NAT скрининг вирусных инфекций у доноров повышает безопасность крови // Клиническая лабораторная диагностика. 2006. № 12. С. 22−23.
  6. А. В., Кузякин А. О., Кочетков С. Н. Молекулярная биология вируса гепатита С // Успехи’биологической химии. 2005. Т. 45. С. 3786
  7. HCV в рутинной лабораторной практике / О. Ю. Шипулина и др.: тез. докл. 6iй всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика»., М., 2007. Т. 1. С. 289−293.
  8. Маркеры вируса гепатита С при коинфицировании ВИЧ у больных из пермского края / Л. И. Николаева и др.: тез. докл. 6-й всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика», М., 2007. Т. 1. С. 132−134.
  9. Метод повышения точности ПЦР «в реальном времени» Д. Ю. Трофимов и др. // Доклады академии наук, 2008. Т. 419. № 3. С. 421−424.
  10. Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции / В. В. Покровский и др. М., 1995. 5с.
  11. М.И. Лабораторная диагностика гепатита С (серологические маркеры и методы их выявления) // Вирусные гепатиты: достижения и перспективы. Информационный бюллетень. 2001. Т. 2. № 12.
  12. Момыналиев К. Т, Говорун В. М. Перспективы применения методов ДНК-диагностики в лабораторной службе. //Клиническая лабораторная диагностика. 2000. № 4. С.25−32.
  13. A.A. Выявление и идентификация респираторных вирусов методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени: дис.. канд. биологических наук. М., 2008. 141 с.
  14. Окончательны ли результаты скрининга антител к вирусу гепатита С у доноров крови? / Е. Б. Жибурт и др. // Вестн. службы крови России. 2004. № 4. С. 17−19.
  15. Определение ДНК-полимеразной и нуклеазной активностей ДНК-зависимых полимераз с использованием флуоресцентной детекции в режимереального времени / А. Г. Брагин и др. // Биохимия. 2008. Т. 73. №. 9. С. 12 521 264.
  16. И.В. Изучение генетического разнообразия изолятов вируса гепатита С и факторов риска инфицирования у пациентов с острыми и хроническими гепатитами в Новосибирске: автореф. дис.. канд. медицинских наук. Кольцово., 2009. 23 с.
  17. Н.И. разработка тест-систем на основе полимеразной цепной реакции (ПНР) в реальном времени для диагностики туберкулеза: дис.. канд. биологических наук. М., 2006. 163 с.
  18. ПЦР «в реальном времени» / Д. В. Ребриков и др. М.-.БИНОМ, 2009. 223с.
  19. Разработка неконкурентного экзогенного внутреннего контроля ПЦР с детекцией в режиме реального времени по принципу UFA / М. К. Иванов и др. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2009. № 3. С. 813.
  20. Распространение генотипов вируса гепатита С, циркулирующих на территориях Северо-Западной и Центральной частей России/ Д. К. Львов и др. //Вопросы вирусологии. 1995. № 6. С. 251−253.
  21. Распространение гепатита С и отдельных генотипов вируса гепатита С в регионе с умеренной активностью эпидемического процесса. / С. Н. Кузин и др. // Вопросы вирусологии. 1999. № 2. С.79−82.
  22. Д. В., Трофимов Д. Ю. ПЦР «в реальном времени»: подходы к анализу данных // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т. 42. С. 520−528.
  23. Спектр генотипов вируса гепатита С, циркулирующих на территории томской области / С. В. Вожаков и др.: тез. докл. 7-й всероссийской* научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика»., М., 2010, Т. 1. С. 206−208.
  24. А.В. Генотипическое разнообразие изолятов и молекулярная вариабельность вируса гепатита С у населения новосибирской области: дис.. канд. биологических наук. Кольцово., 2003. 209 с.
  25. Д.Н. Метод видоспецифичной идентификации патогенных для человека ортопоксвирусов на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени: автореф. дис.. канд. биологических наук. Кольцово., 2010. 27 с.
  26. A data-driven clustering method for time course gene expression data / P. Ma et al. //Nucleic Acids Res. 2006. 34. (4). P. 1261−1269.
  27. A novel sequence found at the 3' terminus of hepatitis С virus genome / T. Tanaka et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. 215. (2). P. 744−749.
  28. A real-time Taqman method for hepatitis С virus genotyping / K.J. Rolfe et al. // Methods Mol. Biol. 2009. 510. P. 55−71
  29. Ailenberg M., Silverman M. Controlled hot start and improved specificity in carrying out PCR utilizing touch-up and loop incorporated primers (TULIPS) // Biotechniques 2000. 29. P. 1018−1024.
  30. Alfaresi M.S., Elkoush A.A. Determination of hepatitis C virus genotypes by melting-curve analysis of quantitative polymerase chain reaction products // Indian J Med-Microbiol. 2007. 25. (3). P. 249−252.
  31. Alter J. Epidemiology of viral hepatitis and HIV coinfection // J. Hepatol. 2006. 44. P. 56−59.
  32. Amplification efficiency of thermostable DNA polymerases / B. Arezi et al. // Anal Biochem., 2003. 321. (2). P. 226−235.
  33. Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data / J.M. Ruijter // Nucleic Acids Res. 2009. 37. (6) P. e45.
  34. An overview of real-time quantitative PCR: applications to quantify cytokine gene expression / A. Giulietti et al. // Methods. 2001. 25. (4). P. 386−401.
  35. Andonov A., Chaudhary R. K. Genotyping of Canadian Hepatitis C Virus Isolates by PCR // Journal Of Clinical Microbiology 1994. 32. (8). P. 20 312 034.
  36. Assessment of spontaneous fluctuations of viral load in untreated patients with chronic hepatitis C by two standardized quantitation methods: branched DNA and Amplicor Monitor / P. Halfon et al. // J. Clin. Microbiol. 1998. 36. (7). P. 2073−2075.
  37. Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data / C. Ramakers et al. //Neurosci. Lett. 2003. 339. (1). P. 62−66.
  38. At least five related, but distinct, hepatitis C viral genotypes exist / T.A. Cha et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1992. 89. (15). P. 7144−7148.
  39. Automated Multiplex Assay System for Simultaneous Detection of Hepatitis B Virus DNA, Hepatitis C Virus RNA, and Human Immunodeficiency Virus Type 1 RNA / Q. Meng et al. // J. Clin. Microbiol. 2001. 39. (8). P: 29 372 945.
  40. Ball T.B., Plummer F.A., HayGlass K.T. Improved mRNA quantitation in LightCycler RT-PCR// Int. Arch. Allergy Immunol. 2003. 130. (1). P. 82−86.
  41. Berger A., Preiser W., Doerr H.W. The role of viral load determination for the management of human immunodeficiency virus, hepatitis B virus and hepatitis C virus infection // Journal of Clinical Virology 2001. 20. (.1−2). P. 23−30.
  42. Bergstrom D.E., Zhang P., Johnson W.T. Comparison of the base pairing properties of a series of nitroazole nucleobase analogs in the oligodeoxyribonucleotide sequence 5'- d (CGCXAATTYGCG)-3' // Nucleic Acids Res. 1997. 25. (10). P. 1935−1942.
  43. Bhagani S. HIV/hepatitis C co-infection and hepatic fibrosis: looking beyond HIV-associated immune suppression- the contribution of hepatic steatosis and insulin resistance// Gut. 2009. 58. (12). P. 1579−1581.
  44. Bostan N., Mahmood T. An overview about hepatitis C: a devastating virus // Crit. Rev. Microbiol. 2010. 36. (2). P. 91−133.
  45. Bukh J., Miller R.H., Purcell R.H. Genetic heterogeneity of hepatitis C virus: quasispecies and genotypes. // Semin. Liver Dis. 1995. 15. (1). P. 41−63.
  46. Bukh J., Purcell R. H, Miller R.H. Importance of primer selection for the detection of hepatitis C virus RNA with the polymerase chain reaction assay // Proc. Natl. Acad. ScL USA. 1992. 89. (1). P. 187−191.
  47. Bukh J., Purcell R.H., Miller R.H. At least 12 genotypes of hepatitis C virus predicted by sequence analysis of the putative El gene of isolates collected worldwide // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. 90. (17). P. 8234−8238
  48. Bullock G.C., Bruns D.E., Haverstick D.M. Hepatitis C Genotype Determination by Melting Curve Analysis with a Single Set of Fluorescence Resonance Energy Transfer Probes // Clinical Chemistry. 2002. 48. (12). 2147−2154.
  49. Bustin S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays // J. Mol. Endocrinol. 2000. 25. (2). P." 169−193.
  50. Caruntu F.A., Benea L. Acute hepatitis C virus infection: Diagnosis, pathogenesis, treatment // J. Gastrointestin Liver Dis. 2006. 15. (3). 249−256.
  51. Cellular glycosaminoglycans and low density lipoprotein receptor are involved in hepatitis C virus adsorption / R. Germi et al. // J. Med. Virol. 2002. 68. (2). P. 206−215.
  52. Chayama K. Genotyping Hepatitis C Virus by type-specific primers for PCR based on NS5 region. // Hepatitis C Protocols, Edited by Johnson Yiu-Nam Lau, MD, Humana Press. 1998. P. 165−173.
  53. Chen Z., Week K.E. Hepatitis C virus genotyping: interrogation of the 5' untranslated region cannot accurately distinguish genotypes la and lb // J. Clin. Microbiol. 2002. 40. (9). P. 3127−3134.
  54. Chevaliez S., Pawlotsky J.M. Hepatitis C virus: Virology, diagnosis and management of antiviral therapy // World J. Gastroenterol. 2007. 13. (17). P. 24 612 466.
  55. Classification of hepatitis C virus into six major genotypes and a series of subtypes by phylogenetic analysis of the NS-5 region / P. Simmonds et al. // J. Gen. Virol. 1993. 74. (Pt 11). P. 2391−2399
  56. Clinical evaluation of the COBAS Ampliprep/COBAS TaqMan for HCV RNA quantitation in comparison with the branched-DNA assay / F. Pittaluga et al. // J. Med. Virol. 2008. 80. (2). P. 254−260.
  57. Clinical evaluation of two methods for genotyping Hepatitis C virus based on analysis of the 5'noncoding region / F.S. Nolte et al. // J. Clin. Microbiol. 2003.41.(4). P. 1558−1564.
  58. Comparison of conventional PCR with real-time PCR and branched DNA-based assays for hepatitis C virus RNA quantification and clinical significance for genotypes 1 to 5 / C. Sarrazin et al. // J. Clin. Microbiol. 2006. 44. (3). P. 729 737.
  59. Comparison of performance characteristics of three real-time reverse transcription-PCR test systems for detection and quantification of hepatitis C virus / M.F. Sabato et al. //J. Clin. Microbiol. 2007. 45. (8). P. 2529−2536.
  60. Complete 5' noncoding region is necessary for the efficient internal initiation of hepatitis C virus RNA / S. Fukushi et al. // Biochem. Biophys. Res, Commun. 1994. 199. (2). P. 425−432.
  61. Consensus proposals for wunified system of nomenclature of hepatitis-G virus genotypes / P. Simmond’s et al. // Hepatology. 2005. 42. (4). P.962−973.
  62. Cooper J.P., Hagerman P.J. Analysis of fluorescence energy transfer in duplex and branched DNA molecules // Biochemistry. 1990. 29. (39). P. 9261−9268.
  63. Correlates of hepatitis C virus (HCV) RNA negativity among HCV-seropositive blood donors / M.P. Busch et al. // Transfusion 2006. 46. (3). P. 46 975.
  64. Definition of false positive reaction in screening for hepatitis C virus antibodies / M. Schroter et al. // J. Clin. Microbiol. 1999:37. (1). P. 233−234.
  65. Delayed anti-HCV antibody response in HIV-positive men acutely infected with HCV/E.C. Thomson et al.//AIDS. 2009. 23. (1). P. 89−93.
  66. Detection of multiple hepatitis C virus genotypes in a cohort of injecting drug users / S. Bowden et al. // Journal of Viral Hepatitis. 2005. 12. (3). P. 322−324.
  67. Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluoresence resonance energy transfer / R.A. Cardullo et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1988. 85. (23). P. 8790−8794.
  68. Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence / D. Whitcombe et al. //Nat. Biotechnol. 1999. 17. P. 804−807.
  69. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'—3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase / P.M. Holland et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991. 88. (16) P. 7276−7280.
  70. Determination of hepatitis C virus genotype by Pyrosequencing / E. Elahi et al. //J. Virol. Methods. 2003. 109. (2). P. 171−176.
  71. Development of a simple restriction fragment length polymorphism (RFLP) based assay for HCV genotyping and comparative analysis with geno-typing and serotyping tests / V. Thiers et al. // J. Virol. Methods. 1997. 65. (1). P. 9−17
  72. Diagnosis, management, and treatment of hepatitis C: an update / M.G. Ghany et al. //Hepatology. 2009. 49. (4). P. 1335−1374.
  73. Differences in virological response to pegylated interferon and ribavirin between hepatitis C (HCV)-monoinfected and HTV-HCV coinfected patients / C. Tural et al. // Antivir. Ther. 2008. 13. (8). P. 1047−1055.
  74. DNA damage reduces Taq DNA polymerase fidelity and PCR amplification efficiency / J.A. Sikorsky et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. 355.(2). P. 431−437.
  75. Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene / J.Y. Chun et al. // Nucleic Acids Res. 2007. 35. (6). P. 1−6.
  76. Effect of Hepatitis C Virus (HCV) Genotype on HCV and HIV-1 Disease / T.W. Yoo et al. // J. Infect. Dis. 2005. 191. (1). P. 4−10.
  77. Evaluation of absolute quantitation by nonlinear regression in probe-based real-time PCR / R. Goll et al. // BMC Bioinfonnatics. 2006. 7. P. 107.
  78. Evaluation of an automated, highly sensitive, real-time PCR-based assay (COB AS Ampliprep/COBAS TaqMan) for quantification of HCV RNA / C. Sarrazin et al. // J. Clin. Virol. 2008. 43. (2). P.162−168.
  79. Evaluation of the COBAS TaqMan HCV test with automated sample processing using the MagNA pure LC instrument / J.J. Germer et al. // J. Clin. Microbiol. 2005. 43. (1). P. 293−298.
  80. Evolutionary analysis of variants of hepatitis C virus found in South-East Asia: Comparison with classifications based upon sequence similarity / P. Simmonds et al. // J. Gen. Virol. 1996. 77 (Pt 12). P. 3013−3024
  81. Experience of mandatory nucleic acid test (NAT) screening across all blood organizations in Germany: NAT yield versus breakthrough transmissions / CM. Nubling et al. // Transfusion, 2009. 49. (9). P. 1850−1858.
  82. Expression of hepatitis C virus non-structural 5A protein in the liver of transgenic mice / M. Majumder et al. // FEBS Lett. 2003. 555. (3). P. 528−532.
  83. False-positive reaction between syphilis and hepatitis C infection / Sonmez E. et al. // Isr. J. Med. Sei. 1997. 33. (11). P. 724−727.
  84. False-positive tests for syphilis associated with human immunodeficiency virus and hepatitis B virus infection among intravenous drug abusers / I. Hernandez-Aguado et al. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1998. 17.(11). P. 784−787.
  85. Genotype 3 is associated with accelerated fibrosis progression in chronic hepatitis C / P.Y. Bochud et al. // J Hepatol. 2009. 51. (4). P. 655−666.
  86. Genotypic and Epidemiologic Characteristics of Hepatitis C Virus Infections among Recent Injection Drug User and Nonuser Populations / L. Krekulova et al. // The Journal of Infectious Diseases, 2001. 33. (8). P. 1435−1438.
  87. Genotyping Hepatitis C Virus by Heteroduplex Mobility Analysis Using Temperature Gradient Capillary Electrophoresis / R.L. Margraf et al. // J. Clin. Microbiol. 2004. 42. (10). P. 4545−4551.
  88. Genotyping of hepatitis C virus by melting curve analysis with SYBR Green I / H. Fujigaki et al. // Ann. Clin. Biochem. 2004. 41. (Pt 2). P. 130−132.
  89. Genotyping of hepatitis C virus types 1, 2, 3 and 4 by a one-step LightCycler method using three different pairs of hybridization probes / M. Schroter et al. // J. Clin. Microbiol. 2002. 40. (6). P. 246−250.
  90. Gentle A., Anastasopoulos F., McBrien N.A. High-resolution semiquantitative real-time PCR without the use of a standard curve // Biotechniques. 2001. 31(3). P. 502, 504−506, 508.
  91. Geographical distribution of hepatitis C virus genotypes in blood donors: An international collaborative survey / F. McOmish et al. // J. Clin. Microbiol. 1994. 32(4). P. 884−892.
  92. Germer J.J., Zeindoi N.N. Advances in the molecular diagnosis of hepatitis C and their clinical implications // Mayo Clin. Proc. 2001. 76. (9). P. 911 920.
  93. Haverstick D.M., Bullock G.C., Bruns D.E. Genotyping of hepatitis C virus by melting curve analysis: analytical characteristics and performance // Clin. Chem. 2004. 50. (12). 2405−2407.
  94. Hepatitis C prevalence among Australian injecting drug users in the 1970s and profiles of virus genotypes in the 1970s and 1990s / A J. Freeman et al. // Med. J. Aust. 2000. 172. (12). P. 588−591.
  95. Hepatitis C Viral Kinetics During Treatment With Peg IFN-alpha-2b in HIV/HCV Coinfected Patients as a Function of Baseline CD4+ T-Cell Counts / N.U. Avidan et al. // Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes 2009. 52. (4). P. 452−458.
  96. Hepatitis C virus genotypes and hepatitis G virus in hemodialysis patients from Syria: identification of two novel hepatitis C virus subtypes / A.S. Abdulkarim et al. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1998. 59. (4). P. 571−576.
  97. Hepatitis C virus genotypes: An investigation of type-specific differences in geographic origin and disease / G. Dusheiko et al. // Hepatology. 1994. 19. (1). P. 13−18.
  98. Hepatitis C virus load in associated with human immunodeficiency virus type 1 disease progression in hemophiliacs / E.S. Daar et al. // J.Infect.Dis. 2001. 183.(4). P. 589−595.
  99. Hepatitis C virus types 7, 8 and 9 should be classified as type 6 subtypes / M. Mizokami et al. // J. Hepatol. 1996. 24. (5). P. 622−624.
  100. Hepatitis C virus variants from Jakarta, Indonesia classifiable into novel genotypes in the second (2e and 2f), tenth (10a) and eleventh (11a) genetic groups / H. Tokita etal. //J. Gen. Virol. 1996. 77. (Pt2). P. 293−301.
  101. Hepatitis C virus variants from Vietnam are classifiable into the seventh, eighth, and. ninth major genetic groups / H. Tokita et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. 91. (23). P. 11 022−11 026
  102. Higher rate of sustained virologic response in chronic hepatitis C genotype 6 treated with 48 weeks versus 24 weeks of peginterferon plus ribavirin / M.H. Nguyen et al. // Am. J. Gastroenterol. 2008. 103. (5). P. 1131−1135.
  103. Humoral immune response in acute hepatitis C virus infection / D.M. Netski et al. // Clin. Infect. Dis. 2005. V. 41. (5). P. 667−675.
  104. Identification of genotypes of hepatitis C virus by sequence comparisons in the core, El and NS-5 regions / P. Simmonds et al. // J. Gen. Virol. 1994. 75. (Pt 5) P. 1053−1061.
  105. Impact of HCV 3.0 EIA Relative to HCV 2.0 EIA on Blood-Donor Screening / L.H. Tobler et al. // Transfusion. 2003. 43. (10) P. 1452−1459.
  106. Incidence and estimated rates of residual risk for HIV, hepatitis C, hepatitis B and human T-cell lymphotropic viruses in blood donors in Canada, 19 902 000 / J.A. Chiavetta et al. // Canadian Medical Association Journal. 2003. 169. (8). P. 767−773.
  107. Internal ribosome entry site within hepatitis C virus RNA / K. Tsukiyama-Kohara et al. //J. Virol. 1992. 66. (3). P. 1476−1483.
  108. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome / Q.L. Choo et al. // Science. 1989. 244. P. 359−362.
  109. Jayaraj S., Reid R., Santi D.V. GeMS: an advanced software package for designing synthetic genes // Nuc. Acids Res. 2005. 33. (9). P. 3011−3016.
  110. Jorgensen, P.A., Neuwald, P.D. Standardized hepatitis C virus RNA panels for nucleic acid testing assays// J. Clin. Virol. 2001. 20. P. 35−40.
  111. Khuroo M.S., Khuroo M.S., Dahab-S.T. Meta-analysis: a randomized trial of peginterferon plus ribavirin for the initial treatment of chronic hepatitis C genotype 4 // Aliment Pharmacol. Ther. 2004. 20. (9). P. 931−938.
  112. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions / R. Higuchi et al. // Biotechnology (N Y). 1993. 11. (9). P. 1026−1030.
  113. Koch J.O., Bartenschlager R. Modulation of hepatitis C virus NS5A hyperphosphorylation by nonstructural proteins NS3, NS4A, and NS4B // J. Virol. 1999. 73. (9). P. 7138−7146.
  114. Larionov A, Krause A, Miller W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing // BMC Bioinformatics. 2005. 6. P. 62.
  115. Laughlin T.S., Nuccie B., Rothberg P.G. Genotyping of Hepatitis C Virus by Sequence Analysis of the Amplicon from the Roche Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan Viral Load Assay // J. Clin. Microbiol. 2010. 48. (2). P 671 672.
  116. Le Guillou-Guillemette H., Lunel-Fabiani F. Detection and Quantification of Serum or Plasma HCV RNA: Mini Review of Commercially Available Assays // Methods Mol. Biol. 2009. 510. P. 3−14.
  117. LightCycler qPCR optimisation for low copy number target DNA / I.A. Teo et al. // J. Immunol. Methods. 2002. 270. (1). P. 119−133.
  118. Lindh M., Hannoun C. Genotyping of hepatitis C virus by Taqman realtime PCR// J. Clin. Virol. 2005. 34. (2). P. 108−114.
  119. Liu W., Saint D.A. A new quantitative method of real time reverse transcription polymerase chain reaction assay based on simulation of polymerase chain reaction kinetics // Anal. Biochem. 2002. 302. (1). P. 52−59.
  120. Liu W., Saint D.A. Validation of a quantitative method for real time PCR kinetics // Biochem. Biophys. Res.Commun. 2002. 294. (2). P. 347−353.
  121. Livak K.J. Relative quantification of gene expression // User Bulletin № 2. 1997. 36 p.
  122. Liver fibrosis progression in human immunodeficiency virus and hepatitis C virus coinfected patients. The Multiviric Group / Y. Benhamou et al. // Hepatology. 1999. 30. (4). P. 1054−1058.
  123. Lyamichev V., Brow M.A.D., Dahlberg J.E. Structure-Specific Endonucleolytic Cleavage of Nucleic Acids by Eubacterial DNA Polymerases // Science. 1993. 260. (5109). P. 778−783
  124. Mackay I.M. Real-Time PCR in Microbiology. Norfolk, UK: Caister Academic Press 2007. 454 p.
  125. Mackay I.M., Arden K.E., Nitsche A. Real-time PCR in virology // Nucleic Acids Res. 2002. 30. (6). P. 1292−1305.
  126. Maertens G., Stuyever L. HCV Genotyping by the Line Probe Assay INNO-LiPA HCV II // Hepatitis C Protocols, Edited by Johnson Yiu-Nam Lau M.D., Humana Press. 1998. P. 183−198
  127. Marino J.H., Cook P., Miller K.S. Accurate and statistically verified quantification of relative mRNA abundances using SYBR Green I and real-time RT-PCR // J. Immunol. Methods. 2003. 283. (1−2). P.291−306.
  128. Marked sequence diversity in the putative envelope proteins of hepatitis C viruses / N. Kato et al. // Virus Res. 1992. 22. (2). P. 107−123.
  129. Marras S.A. Selection of fluorophore and quencher pairs for fluorescent nucleic acid hybridization probes // Methods Mol. Biol. 2006. 335. P. 3−16.
  130. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (Mass Spectrometry) for Hepatitis C Virus Genotyping / E.N. Ilina et al. // J. Clin. Microbiol. 2005. 43. (6). P. 2810−2815.
  131. Meta-Analysis: Increased Mortality Associated with Hepatitis C in HIV-infected Persons Is Unrelated to HIV Disease Progression / T.Y. Chen et al. // Clinical Infectious Diseases. 2009. 49. (10). P. 1605−1615.
  132. Method of detecting specific fragments of DNA or RNA with the aid of a polymerase chain reaction. / A.V. Chemeris et al. // European Patent EP1780291. 2007.
  133. Moradpour D., Penin F., Rice C.M. Replication of hepatitis C virus // Nat. Rev. Microbiol. 2007. 5. (6). P. 453−463
  134. Morrison L.E., Haider T.C., Stols L.M. Solution-phase detection of polynucleotides using interacting fluorescent labels and competitive hybridization // Anal. Biochem. 1989 183. (2). P. 231−244.
  135. Morrison T.M., Weis J.J., Wittwer C.T. Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR green I monitoring during amplification // Biotechniques. 1998. 24. (6). P. 954−962.
  136. Mortality from liver cancer and liver disease in hemophilic men and boys in UK given blood products contaminated with hepatitis C. UK Hemophilia Center Director’s Organization / S.C. Darby et al. // Lancet. 1997. 350. (9089). P. 1425−1431.
  137. Multiplex Real-Time Reverse Transcription-PCR Assay for Determination of Hepatitis C Virus Genotypes / L. Cook et al. // Journal Of Clinical Microbiology. 2006. 44. (11). P. 4149−4156.
  138. Nazarenko I.A., Bhatnager S.K., Hohman R.J. A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer // Nucleic Acids Res. 1997. 25.(12). P. 2516−2521.
  139. Neddermann P., Clementi A., De Francesco R. Hyperphosphorylation of the Hepatitis C Virus NS5A Protein Requires an Active NS3 Protease, NS4A, NS4B, and NS5A Encoded on the Same Polyprotein // J. Virol. 1999. 73. (12). P. 9984−9991.
  140. New hepatitis C virus (HCV) genotyping system that allows for identification of HCV genotypes la, lb, 2a, 2b, 3a, 3b, 4, 5a, and 6a / O. Ohno et al. //J. Clin. Microbiol. 1997. 35. (1). P. 201−207.
  141. Nizar N.Z. Clinical Significance of Hepatitis C Virus Genotypes // Clin. Microbiol. Rev. 2000. 13. (2). P. 223−235.
  142. Orland J.R., Wright T.L., Cooper S. Acute hepatitis C // Hepatology. 2001.33.(2). P. 321−327.
  143. Overestimation and underestimation of hepatitis C virus RNA levels in a widely used real-time polymerase chain reaction-based method. / S. Chevaliez et al. // Hepatology. 2007. 46. P. 22−31.
  144. Pawlotsky J.M. Measuring hepatitis C viremia in clinical samples: can we trust the assays? // Hepatology. 1997. 26. (1). P. 1−4.
  145. Pawlotsky J.M., Bouvier-Alias M., Hezode C., Darthuy F., Remire J., Dhumeaux D. Standardization of hepatitis C virus RNA quantification. // Hepatology. 2000. 32. (3). P. 654−659.
  146. Peginterferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C virus infection / M.W. Fried et al. //N. Engl. J. Med. 2002. 347. (13). P. 975−982.
  147. Peginterferon alfa-2b and weight-based or flat-dose ribavirin in chronic hepatitis C patients: a randomized trial / I.M. Jacobson et al. // Hepatology. 2007. 46. (4). P. 971−981.
  148. Peginterferon alfa-2b plus ribavirin compared with interferon alfa-2b plus ribavirin for initial treatment of chronic hepatitis C: a randomised trial / M.P. Manns et al. // Lancet. 2001. V. 358. (9286). P. 958−965.
  149. Peginterferon-alpha2a and ribavirin combination therapy in chronic hepatitis C: a randomized study of treatment duration and ribavirin dose / S.J. Hadziyannis et al. // Ann Intern Med. 2004. 140. (5). P. 346−355.
  150. Pegylated interferon alpha-2b plus ribavirin in patients with genotype 4 chronic hepatitis C: The role of rapid and early virologic response / S.M. Kamal et al. //Hepatology. 2007. 46. (6). P. 1732−1740.
  151. Peirson S.N., Butler J.N., Foster R.G. Experimental validation of novel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis // Nucleic Acids Res. 2003. 31. (14). P. e73.
  152. Performance characteristics of a quantitative TaqMan hepatitis C virus RNA analyte-specific reagent / J.M. Barbeau et al. // J. Clin. Microbiol. 2004. 42. (8). P. 3739−3746.
  153. Performance evaluation of the Abbott RealTime HCV Genotype II for hepatitis C virus genotyping / Y.H. Sohn et al. // Clin. Chem. Lab. Med. 2010. 48. (4). P. 469−474.
  154. Peterson M., Wengel J. LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics // Trends Biotechnol. 2003. 21. (2). P. 74−81.
  155. Pfaffl M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR//Nucleic Acids Res. 2001. 29. (9). P. e45.
  156. Polymerase chain reaction for the detection of HCV-RNA: cryoglobulinaemia as a cause for false negative results / A. Colantoni et al. // Ital. J. Gastroenterol. Hepatol. 1997. 29. (3). P. 273−274.
  157. Population genotyping of hepatitis C virus by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis of short DNA fragments/Kim Y.J. et al.//Clin. Chem. 2005.51.(7). P. 1123−31.
  158. Prevalence and route of transmission of infection with a novel DNA virus (TTV), hepatitis C virus, and hepatitis G virus in patients infected with HIV / F. Puig-Basagoiti et al. // J.Acquir. Immune. Defic. Syndr. 2000. 23. (1). P. 89−94.
  159. Prince A.M., Huima-Byron T., Parker T.S., Levine D.M. Visualization of hepatitis C virions and putative defective interfering particles isolated from low-density lipoproteins // J. Viral. Hepat. 1996. 3. (1). P. 11−17.
  160. Processing of gene expression data generated by quantitative real-time RT-PCR / P.Y. Muller et al. // Biotechniques 2002. 32. (6). P. 1372−1378.
  161. Rapid genotyping of hepatitis C virus by primer-specific extension analysis / N.A. Antonishyn et al. // J. Clin. Microbiol. 2005. 43. (10). P. 51 585 163.
  162. Real-Time PCR / edited by M.T. Dorak. UK: Taylor & Francis Group, 2006. 333 p.
  163. Real-time PCR assays for hepatitis C virus (HCV) RNA quantitation are adequate for clinical management of patients with chronic HCV infection / P. Halfon et al. // J. Clin. Microbiol. 2006. 44, 2507−2511.
  164. Rutledge R.G. Sigmoidal curve-fitting redefines quantitative real-time PCR with the prospective of developing automated high-throughput applications // Nucleic Acids Res. 2004. 32. (22). P. el78.
  165. Rutledge R.G., Cote C. Mathematics of quantitative kinetic PCR and the application of standard curves //Nucleic Acids Res. 2003. 31. (16). P. e93.
  166. SantaLucia J Jr. Physical principles and visual-OMP software for optimal PCR design // Methods Mol. Biol. 2007. 402. P. 3−34.
  167. SantaLucia J.Jr., Hicks D. The thermodynamics of DNA structural motifs // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2004. 33. P. 415−440
  168. Savitzky A., Golay MJ. Smoothing and Differentiation of Data by Simplified Least Squares Procedures // Anal. Chem. 1964. 36. (8). P. 1627−1639.
  169. Scott J.D., Gretch D.R. Molecular diagnostics of hepatitis C virus infection: a systematic review // JAMA. 2007. 297. (7). P. 724−732.
  170. Sensitivity of second-generation enzyme immunoassay for detection of hepatitis C virus infection-among oncology patients / A. Macedo de Oliveira et al:. // J. Clin. Virol. 2006 Jan-35. (1). P. 21−25.
  171. Simmonds P. Genetic diversity and evolution of hepatitis C virus 15 years on //J. Gen. Virol. 2004. 85. (Pt 11). P. 3173−3188
  172. Simplified hepatitis C virus genotyping by heteroduplex mobility analysis / P.A. White et al.7/ J. Clin. Microbiol. 2000. 38. (2). P. 477−482.
  173. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences / R. Higuchi et ah. //Biotechnology. 1992. 10. P. 413−417.
  174. Simultaneous fitting of real-time PCR data with efficiency of amplification modeled as Gaussian function of target fluorescence / A. Batsch et al. // BMC Bioinformatics 2008. 9. P. 95.
  175. Standardization of hepatitis C virus RNA quantification / J.M. Pawlotsky et al. //Hepatology, 2000. 32. (3). P. 654−659.
  176. Standardized determination of real-time PCR efficiency from a single reaction set-up / A. Tichopad et al. //Nucleic acids Res. 2003. 31. (20). P. el22.
  177. Storage conditions of-blood samples and primer selection affect the yield of cDNA polymerase chain reaction products of hepatitis C virus. / H.T. Cuypers et al. // J. Clin. Microbiol. 1992. 30. (12). P.3220−3224.
  178. Structure of the 3' terminus of the hepatitis C virus genome / T. Tanaka et al. //J. Virol. 1996. 70. (5). P. 3307−3312.
  179. Survey of major genotypes and subtypes of hepatitis C virus using RFLP of sequences amplified from the 5' non-coding region / F. Davidson et al. // J. Gen- Virol. 1995. 76. P. 1197−1204.
  180. Sy T., Jamal M. Epidemiology of Hepatitis C Virus (HCV) Infection // Int. J. Med. Sei. 2006. 3. (2). P. 41−46.
  181. The association between hepatitis C virus genotype and human immunodeficiency virus disease progression in a cohort of hemophilic men / C.A. Sabin et al.//J. Infect. Dis. 1997. 175.(1). P. 164−168.
  182. The complete coding sequence of hepatitis C virus genotype 5a, the predominant genotype in South Africa / R.W. Chamberlain et al. // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1997. 236. (1). P. 44−49.
  183. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR / J. Brownie et al. //Nucleic Acids Res. 1997. 25. (16). P.3235−3241.
  184. The impact of chronic hepatitis C virus infection on HIV disease and progression in intravenous drug users / G.H. Haydon et al. // Eur.J.Gastroenterol.Hepatol. 1998. 10. (6). P. 485−489.
  185. The management of chronic viral hepatitis: a Canadian consensus conference / M. Sherman et al. // Can. J. Gastroenterol. 2004. 18. (12). P. 715−728.
  186. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments / S.A. Bustin et al. // Clin. Chem. 2009. 55. (4). P. 611−622.
  187. The particle size of hepatitis C virus estimated by filtration through microporous regenerated cellulose fibre / T. Yuasa et al. // J. Gen. Virol. 1991. 72. (Pt 8). P. 2021−2024.
  188. The prognostic value of a single hepatitis C virus RNA load measurement taken early after human immunodeficiency virus seroconversion / E. Herrero-Martinez et al. //J. Infect. Dis. 2002. 186. (4). P. 470−476.
  189. The significance of third-generation HCV RIBA-indeterminate, RNA-negative results in voluntary blood donors screened with sequential third-generation immunoassays / P. Kiely et al. // Transfusion. 2004. 44. (3). P. 349−358.
  190. The unique HCV genotype distribution and the discovery of a novel subtype 6u among IDUs co-infected with HIV-1 in Yunnan, China / X. Xia et al. // J. Med. Virol. 2008. 80. (7). P. 1142−1152.
  191. The use of a thermally activated DNA polymerase PCR gives improved specificity, sensitivity and product yield without additives or extra process steps / D.E. Birch et al. //Nature 1996. 381. P. 445−446.
  192. Tichopad A., Didier A., Pfaffl M.W. Inhibition of real-time RT-PCR quantification due to tissue specific contaminants // Mol. Cel. Probes, 2004. 18. (1) P: 45−50.
  193. Tissue donation and virus safety: more nucleic acid amplification testing is needed / A. Pruss et al. // Transpl. Infect. Dis. 2010. 12. (5). P. 375−386.
  194. Tyagi S., Bratu D.P., Kramer F.R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination//Nat. Biotechnol. 1998. 16. (1). P. 49−53.
  195. Typing hepatitis C virus by polymerase chain reaction with type-specific primers: application to clinical surveys and* tracing infectious sources / H. Okamoto et al. // J. Gen. Virology. 1992. 73 (Pt3). P. 673−679.
  196. Typing of hepatitis C virus isolates and characterization of new subtypes using a line probe assay / L. Stuyver et al. // J. Gen. Virol. 1993. 74. P. 10 931 102.
  197. Visualization of hepatitis C virions and putative defective interfering particles isolated from low-density lipoproteins / A.M. Prince et al. // J. Viral. Hepat. 1996.3.(1). P. 11−17.
  198. Walter N.G., Burke J.M. Real-time monitoring of hairpin ribozyme kinetics through base-specific quenching of fluorescein-labeled substrates // RNA. 1997. 3. (4). P. 392−404.
  199. Wang C., Sarnow P., Siddiqui A. Translation of human hepatitis C virus RNA in cultured cells is mediated by an internal ribosome-binding mechanism // J.Virol. 1993. 67. (6). P. 3338−3344.
  200. Watkins N.E. Jr., SantaLucia J. Jr. Nearest-neighbor thermodynamics of deoxyinosine pairs in DNA duplexes // Nucleic Acids Res. 2005. 33. (19). P. 62 586 267.
  201. Wetmur, J.G. DNA probes: applications of the principles of nucleic acid hybridization // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1991. 26. (3−4). P. 227−259.
  202. Wilhelm J., Pingoud A., Hahn M. SoFAR: software for fully automatic evaluation of real-time PCR data // Biotechniques. 2003. 34. (2). P. 324−332.
  203. Wittwer C.T., Gutekunst M., Lohmann S. Method for quantification of an analyte US patent 6 503 720 B2.
  204. Wong M.L., Medrano J.F. Real-time PCR for mRNA quantitation // Biotechniques. 2005. 39. (1). P. 75−85.
  205. Wong T., Lee S.S. Hepatitis C: a review for primary care physicians // CMAJ. 2006. 174. (5). P. 649−659
  206. Yoo< H.Y., Maheshwari A., Thuluvath P.J. Retransplantation of liver: primary graft nonfunction and hepatitis С virus are associated with worse outcome // Liver Transpl. 2003. 9. (9). P. 897−904.
  207. Zein N.N. Clinical significance of hepatitis С virus genotypes // Clin. Microbiol. Rev. 2000. 13. (2). P. 223−235
  208. Zhao S., Fernald R.D. Comprehensive algorithm for quantitative realtime polymerase chain reaction // J. Comput. Biol. 2005. 12. (8). P. 1047−64.
Заполнить форму текущей работой

Заказал и сдал!