ΠΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ ΠΊΠΎΠ½ΡΡΡΡΠΊΡΠΈΠΉ, ΠΎΠ±Π΅ΡΠΏΠ΅ΡΠΈΠ²Π°ΡΡΠΈΡ ΠΊΠΎΠ½ΡΡΠΎΠ»ΠΈΡΡΠ΅ΠΌΠΎΠ΅ ΡΡΠΈΠ»Π΅Π½ΠΈΠ΅ Π³Π΅Π½ΠΎΠ² Π² ΡΡΠ°Π½ΡΠ³Π΅Π½Π½ΡΡ ΡΠ°ΡΡΠ΅Π½ΠΈΡΡ
ΠΠ±ΡΠ΅ΠΊΡΠ°ΠΌΠΈ ΠΈΡΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΠΏΠΎΡΠ»ΡΠΆΠΈΠ»ΠΈ ΡΠΈΠ½ΡΠ΅ΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΈΠ΅ ΡΡΠ°Π½ΡΠ»ΡΡΠΈΠΎΠ½Π½ΡΠ΅ ΡΠ½Ρ Π°Π½ΡΠ΅ΡΡ, ΠΌΠΈΠ½ΠΈΠΌΠ°Π»ΡΠ½ΡΠΉ 35S-ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡ Π²ΠΈΡΡΡΠ° ΠΌΠΎΠ·Π°ΠΈΠΊΠΈ ΡΠ²Π΅ΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΊΠ°ΠΏΡΡΡΡ, ΡΠ»Π΅ΠΌΠ΅Π½Ρ ΡΠ΅ΠΏΠ»ΠΎΠ²ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠΎΠΊΠ°, ΡΠ΅ΠΏΠΎΡΡΠ΅ΡΠ½ΡΠΉ Π³Π΅Π½ Π²-Π³Π»ΡΠΊΡΡΡΠ½ΠΈΠ΄Π°Π·Ρ (GUS) ΠΈ Π³Π΅Π½ ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΠ° ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»Π°Π·Ρ 7Π ΠΈΠ· Π³ΡΠΈΠ±Π° Lentinulaedodes. ΠΠΎΠ½ΡΡΡΡΠΊΡΠΈΠΈ, Π±ΡΠ»ΠΈ ΡΠΎΠ·Π΄Π°Π½Ρ ΠΏΡΡΠ΅ΠΌ Π²ΡΡΠ°Π²ΠΊΠΈ Π² ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Ρ pCAMBIA 2300 ΠΊΠ°ΡΡΠ΅ΡΡ, ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°ΡΠ΅ΠΉ ΡΠ»Π΅ΠΌΠ΅Π½Ρ ΡΠ΅ΠΏΠ»ΠΎΠ²ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠΎΠΊΠ° ΠΈΠ· ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Ρ pSGH2 ΠΈ ΠΌΠΈΠ½ΠΈΠΌΠ°Π»ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ 35S-ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡΠ°… Π§ΠΈΡΠ°ΡΡ Π΅ΡΡ >
ΠΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ ΠΊΠΎΠ½ΡΡΡΡΠΊΡΠΈΠΉ, ΠΎΠ±Π΅ΡΠΏΠ΅ΡΠΈΠ²Π°ΡΡΠΈΡ ΠΊΠΎΠ½ΡΡΠΎΠ»ΠΈΡΡΠ΅ΠΌΠΎΠ΅ ΡΡΠΈΠ»Π΅Π½ΠΈΠ΅ Π³Π΅Π½ΠΎΠ² Π² ΡΡΠ°Π½ΡΠ³Π΅Π½Π½ΡΡ ΡΠ°ΡΡΠ΅Π½ΠΈΡΡ (ΡΠ΅ΡΠ΅ΡΠ°Ρ, ΠΊΡΡΡΠΎΠ²Π°Ρ, Π΄ΠΈΠΏΠ»ΠΎΠΌ, ΠΊΠΎΠ½ΡΡΠΎΠ»ΡΠ½Π°Ρ)
ΠΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ ΠΊΠΎΠ½ΡΡΡΡΠΊΡΠΈΠΉ, ΠΎΠ±Π΅ΡΠΏΠ΅ΡΠΈΠ²Π°ΡΡΠΈΡ ΠΊΠΎΠ½ΡΡΠΎΠ»ΠΈΡΡΠ΅ΠΌΠΎΠ΅ ΡΡΠΈΠ»Π΅Π½ΠΈΠ΅ Π³Π΅Π½ΠΎΠ² Π² ΡΡΠ°Π½ΡΠ³Π΅Π½Π½ΡΡ ΡΠ°ΡΡΠ΅Π½ΠΈΡΡ
ΠΠΎΠΌΠΏΡΡΡΠ΅ΡΠ½ΡΠΉ Π°Π½Π°Π»ΠΈΠ· ΠΏΠΎΠΊΠ°Π·Π°Π», ΡΡΠΎ ΠΌΠ ΠΠ ΡΡΡΠ΅ΡΡΠΎΠ²ΡΡ Π±Π΅Π»ΠΊΠΎΠ² (Π² ΡΡΠ»ΠΎΠ²ΠΈΡΡ Π³ΠΈΠΏΠ΅ΡΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠΈ ΠΈΠ»ΠΈ Π³ΠΈΠΏΠΎΠΊΡΠΈΠΈ) ΡΠ°ΠΊΠΈΡ ΠΊΠ°ΠΊ Π±Π΅Π»ΠΊΠΈ ΡΠ΅ΠΏΠ»ΠΎΠ²ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠΎΠΊΠ° (HSP) ΠΈΠ»ΠΈ Π³Π΅Π½ Π°Π»ΠΊΠΎΠ³ΠΎΠ»ΡΠ΄Π΅Π³ΠΈΠ΄ΡΠΎΠ³Π΅Π½Π°Π·Ρ (Adh), ΡΡΠ°Π½ΡΠ»ΠΈΡΡΡΡΡΡ Π½Π°ΠΌΠ½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΡΡΠ΅ΠΊΡΠΈΠ²Π½Π΅Π΅, ΡΠ΅ΠΌ ΠΏΡΠΈ ΠΎΠ±ΡΡΠ½ΡΡ ΡΠΈΠ·ΠΈΠΎΠ»ΠΎΠ³ΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΈΡ ΡΡΠ»ΠΎΠ²ΠΈΡΡ . ΠΡΠΈΠΌ ΠΎΠ½ΠΈ ΠΎΠ±ΡΠ·Π°Π½Ρ ΡΠ½Ρ Π°Π½ΡΠ΅ΡΠ½ΡΠΌ ΡΡΠ°ΡΡΠΊΠ°ΠΌ, Π²Ρ ΠΎΠ΄ΡΡΠΈΠΌ Π² ΡΠΎΡΡΠ°Π² ΠΈΡ Π»ΠΈΠ΄Π΅ΡΠ½ΡΡ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΠ΅ΠΉ. Π Π΄ΠΎΠΏΠΎΠ»Π½Π΅Π½ΠΈΠ΅ ΠΊ ΡΡΠΎΠΌΡ, ΡΠΊΡΠΏΡΠ΅ΡΡΠΈΡ Π³Π΅Π½ΠΎΠ² Π°ΠΊΡΠΈΠ²ΠΈΡΡΠ΅ΡΡΡ ΡΠΎΠ»ΡΠΊΠΎ ΠΏΡΠΈ ΡΡΡΠ΅ΡΡΠΎΠ²ΡΡ ΡΡΠ»ΠΎΠ²ΠΈΡΡ Π² Π²ΠΈΠ΄Ρ Π½Π°Π»ΠΈΡΠΈΡ ΡΠ΅Π³ΡΠ»ΡΡΠΎΡΠ½ΡΡ ΠΎΠ±Π»Π°ΡΡΠ΅ΠΉ Π² ΡΡΠ°ΡΡΠΊΠ΅ ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡΠ° (HSEΠΈΠ»ΠΈARE). Π£ΡΠΈΡΡΠ²Π°Ρ ΡΡΠΈ ΠΎΡΠΎΠ±Π΅Π½Π½ΠΎΡΡΠΈ ΠΊΠΎΠ½ΡΡΡΡΠΊΡΠΈΠΉ Π² Π½Π°ΡΡΠΎΡΡΠ΅Π΅ Π²ΡΠ΅ΠΌΡ, Π²ΡΠ΅ Π±ΠΎΠ»ΡΡΠ΅ ΡΠ°ΡΡΠΈΡΡΠ΅ΡΡΡ ΠΏΠΎΠ»Π΅ ΠΈΡ ΠΏΡΠ°ΠΊΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΎΠ³ΠΎ ΠΏΡΠΈΠΌΠ΅Π½Π΅Π½ΠΈΡ. ΠΠ΄Π½ΠΈΠΌ ΠΈΠ· Π½Π°ΠΏΡΠ°Π²Π»Π΅Π½ΠΈΠΉ ΡΠ²Π»ΡΠ΅ΡΡΡ ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ ΡΡΠ°Π½ΡΠ³Π΅Π½Π½ΡΡ ΡΠ°ΡΡΠ΅Π½ΠΈΠΉ Ρ Π²ΡΡΡΠΎΠ΅Π½Π½ΡΠΌΠΈ ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»Π°Π·Π½ΡΠΌΠΈ Π³Π΅Π½Π°ΠΌΠΈ Π΄Π»Ρ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΠΈΡ Π² ΠΏΡΠΎΠΈΠ·Π²ΠΎΠ΄ΡΡΠ²Π΅ Π±ΠΈΠΎΡΡΠ°Π½ΠΎΠ»Π°.
ΠΠ° ΡΠ΅Π³ΠΎΠ΄Π½Ρ ΡΠ°ΠΌΡΠΌ ΡΠΊΠΎΠ½ΠΎΠΌΠΈΡΠ½ΡΠΌ ΡΠΏΠΎΡΠΎΠ±ΠΎΠΌ ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½ΠΈΡ ΡΡΠ°Π½ΠΎΠ»Π° ΠΈΠ· ΡΠ°ΡΡΠΈΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΡΡΡΡ ΡΡΠΈΡΠ°Π΅ΡΡΡ ΠΎΠ΄Π½ΠΎΠ²ΡΠ΅ΠΌΠ΅Π½Π½ΡΠΉ ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΠ°ΡΠΈΠ²Π½ΡΠΉ Π³ΠΈΠ΄ΡΠΎΠ»ΠΈΠ· ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»ΠΎΠ·Ρ ΠΈ Π³Π΅ΠΌΠΈΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»ΠΎΠ·Ρ Ρ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΡΡΡΠ΅ΠΉ ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΠ°ΡΠΈΠ΅ΠΉ ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ°Π΅ΠΌΡΡ ΡΠ²ΠΎΠ±ΠΎΠ΄Π½ΡΡ ΡΠ°Ρ Π°ΡΠΎΠ² Π΄ΠΎ ΡΡΠ°Π½ΠΎΠ»Π°. Π Π½Π°ΡΡΠΎΡΡΠ΅Π΅ Π²ΡΠ΅ΠΌΡ Π²ΡΠ΅ ΡΠ°ΡΠ΅ ΠΏΡΠ΅Π΄Π»Π°Π³Π°Π΅ΡΡΡ Π½ΠΎΠ²Π°Ρ ΡΠ΅Ρ Π½ΠΎΠ»ΠΎΠ³ΠΈΡ ΡΠΊΡΠΏΡΠ΅ΡΡΠΈΠΈ Π³Π΅Π½ΠΎΠ² ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»Π°Π·Ρ, Π²ΡΠ΄Π΅Π»Π΅Π½Π½ΡΡ ΠΈΠ· ΡΠΈΡΡΡΡ ΡΡΠ°ΠΌΠΌΠΎΠ² Π³ΡΠΈΠ±Π° Lentinullaedodes (Π±ΠΎΠ»Π΅Π΅ ΠΈΠ·Π²Π΅ΡΡΠ½Ρ ΠΊΠ°ΠΊ Π³ΡΠΈΠ±Ρ Shiitake), ΡΠΏΠΎΡΠΎΠ±Π½ΡΡ ΠΊ ΠΏΠ΅ΡΠ΅ΡΠ°Π±ΠΎΡΠΊΠ΅ ΡΠ°ΡΡΠΈΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΠΉ Π±ΠΈΠΎΠΌΠ°ΡΡΡ (ΠΎΡΡ ΠΎΠ΄Ρ Ρ/Ρ ΠΏΡΠΎΠΈΠ·Π²ΠΎΠ΄ΡΡΠ²Π°, ΡΠ°ΠΊΠΈΡ ΠΊΠ°ΠΊ ΡΠΎΠ»ΠΎΠΌΠ° Π·Π»Π°ΠΊΠΎΠ², ΠΎΠΏΠΈΠ»ΠΊΠΈ ΠΈ Ρ. Π΄.) Π΄ΠΎ ΠΏΡΠΎΡΡΡΡ ΡΠ°Ρ Π°ΡΠΎΠ². ΠΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½Π½ΡΠ΅ ΡΠ°Ρ Π°ΡΠ° Π² Π΄Π°Π»ΡΠ½Π΅ΠΉΡΠ΅ΠΌ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΡΡΡΡΡ ΠΊΠ°ΠΊ ΡΡΡΡΠ΅ Π΄Π»Ρ ΠΏΡΠΎΠΌΡΡΠ»Π΅Π½Π½ΠΎΠ³ΠΎ ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½ΠΈΡ Π±ΠΈΠΎΡΡΠ°Π½ΠΎΠ»Π°. Π‘Π΅Π³ΠΎΠ΄Π½Ρ Π² Π²Π΅Π΄ΡΡΠΈΡ ΠΊΠΎΠΌΠΏΠ°Π½ΠΈΡΡ ΠΌΠΈΡΠ° ΡΠ°ΡΡΠΌΠ°ΡΡΠΈΠ²Π°ΡΡΡΡ Π²ΠΎΠ·ΠΌΠΎΠΆΠ½ΠΎΡΡΠΈ, ΠΈ ΠΏΡΠΎΠ²ΠΎΠ΄ΡΡΡΡ ΡΠΊΡΠΏΠ΅ΡΠΈΠΌΠ΅Π½ΡΡ ΠΏΠΎ ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½ΠΈΡ ΡΡΠ°Π½ΡΠ³Π΅Π½Π½ΡΡ ΡΠ°ΡΡΠ΅Π½ΠΈΠΉ, ΡΠΏΠΎΡΠΎΠ±Π½ΡΡ ΠΏΡΠΈ ΠΎΠΏΡΠ΅Π΄Π΅Π»Π΅Π½Π½ΡΡ ΡΡΠ»ΠΎΠ²ΠΈΡΡ (ΠΏΠΎΠ²ΡΡΠ΅Π½Π½ΡΠ΅ ΡΠ΅ΠΌΠΏΠ΅ΡΠ°ΡΡΡΡ Π΄ΠΎ 37Π‘) ΠΏΠΎΡΠ»Π΅ ΡΠΊΠ°ΡΠΈΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΠΈ ΡΠΊΠ»Π°Π΄ΠΊΠΈ Π² Π΅ΠΌΠΊΠΎΡΡΠΈ, Π·Π°ΠΏΡΡΠΊΠ°ΡΡ ΡΠΈΠ½ΡΠ΅Π· ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΠΎΠ² (ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»Π°Π·). Π ΡΠ΅Π·ΡΠ»ΡΡΠ°ΡΠ΅ ΡΠ°Π±ΠΎΡΡ Π²ΡΡΡΠΎΠ΅Π½Π½ΡΡ Π³Π΅Π½ΠΎΠ², ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΡ ΡΠ°ΡΡΠ΅ΠΏΠ»ΡΡΡ ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»ΠΎΠ·Ρ Π΄ΠΎ ΡΠ²ΠΎΠ±ΠΎΠ΄Π½ΡΡ ΡΠ°Ρ Π°ΡΠΎΠ² Ρ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΡΡΡΠΈΠΌ ΡΠ±ΡΠ°ΠΆΠΈΠ²Π°Π½ΠΈΠ΅ΠΌ Π΄ΠΎ ΡΡΠ°Π½ΠΎΠ»Π°.
Π¦Π΅Π»ΡΡ Π½Π°ΡΡΠΎΡΡΠΈΡ ΠΈΡΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠΉ ΡΠ²Π»ΡΠ΅ΡΡΡ ΡΠΎΠ·Π΄Π°Π½ΠΈΠ΅ ΠΌΠΎΠ΄Π΅Π»ΡΠ½ΡΡ ΠΊΠΎΠ½ΡΡΡΡΠΊΡΠΈΠΉ, ΠΎΠ±Π΅ΡΠΏΠ΅ΡΠΈΠ²Π°ΡΡΠΈΡ ΠΊΠΎΠ½ΡΡΠΎΠ»ΠΈΡΡΠ΅ΠΌΡΠΉ ΡΠΈΠ½ΡΠ΅Π· ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΠ° ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»Π°Π·Ρ 7Π ΠΈΠ· Π³ΡΠΈΠ±Π° Lentinulaedodes (Shiitake).
ΠΠ±ΡΠ΅ΠΊΡΠ°ΠΌΠΈ ΠΈΡΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ ΠΏΠΎΡΠ»ΡΠΆΠΈΠ»ΠΈ ΡΠΈΠ½ΡΠ΅ΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΈΠ΅ ΡΡΠ°Π½ΡΠ»ΡΡΠΈΠΎΠ½Π½ΡΠ΅ ΡΠ½Ρ Π°Π½ΡΠ΅ΡΡ, ΠΌΠΈΠ½ΠΈΠΌΠ°Π»ΡΠ½ΡΠΉ 35S-ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡ Π²ΠΈΡΡΡΠ° ΠΌΠΎΠ·Π°ΠΈΠΊΠΈ ΡΠ²Π΅ΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΊΠ°ΠΏΡΡΡΡ, ΡΠ»Π΅ΠΌΠ΅Π½Ρ ΡΠ΅ΠΏΠ»ΠΎΠ²ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠΎΠΊΠ°, ΡΠ΅ΠΏΠΎΡΡΠ΅ΡΠ½ΡΠΉ Π³Π΅Π½ Π²-Π³Π»ΡΠΊΡΡΡΠ½ΠΈΠ΄Π°Π·Ρ (GUS) ΠΈ Π³Π΅Π½ ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΠ° ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»Π°Π·Ρ 7Π ΠΈΠ· Π³ΡΠΈΠ±Π° Lentinulaedodes. ΠΠΎΠ½ΡΡΡΡΠΊΡΠΈΠΈ, Π±ΡΠ»ΠΈ ΡΠΎΠ·Π΄Π°Π½Ρ ΠΏΡΡΠ΅ΠΌ Π²ΡΡΠ°Π²ΠΊΠΈ Π² ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Ρ pCAMBIA 2300 ΠΊΠ°ΡΡΠ΅ΡΡ, ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°ΡΠ΅ΠΉ ΡΠ»Π΅ΠΌΠ΅Π½Ρ ΡΠ΅ΠΏΠ»ΠΎΠ²ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠΎΠΊΠ° ΠΈΠ· ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Ρ pSGH2 ΠΈ ΠΌΠΈΠ½ΠΈΠΌΠ°Π»ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ 35S-ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡΠ° (-60) Π²ΠΈΡΡΡΠ° ΠΌΠΎΠ·Π°ΠΈΠΊΠΈ ΡΠ²Π΅ΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΊΠ°ΠΏΡΡΡΡ ΠΏΠΎ ΡΠ°ΠΉΡΠ°ΠΌ ΡΠ΅ΡΡΡΠΈΠΊΡΠΈΠΈ HindIIIΠΈ NcoI. Π’Π°ΠΊ ΠΆΠ΅ ΠΏΠΎ ΡΠ°ΠΉΡΠ°ΠΌ ΡΠ΅ΡΡΡΠΈΠΊΡΠΈΠΈ NdeI ΠΈ EcoRI Π² ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Ρ Π±ΡΠ» Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»Π΅Π½ ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΎΡ Π½ΠΎΠΏΠ°Π»ΠΈΠ½ ΡΠΈΠ½ΡΠ°Π·Ρ (NOS-terminator), ΠΎΡΠ²Π΅ΡΡΡΠ²Π΅Π½Π½ΡΠΉ Π·Π° ΡΠΈΠ³Π½Π°Π» ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠ°Π΄Π΅Π½ΠΈΠ»ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ.
ΠΠΎΠ»ΡΡΠΎΠ΅ Π²Π½ΠΈΠΌΠ°Π½ΠΈΠ΅ Π² ΡΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈΠΈ 30 ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄Π½ΠΈΡ Π»Π΅Ρ ΡΠ΄Π΅Π»Π΅Π½ΠΎ ΠΈΠ·ΡΡΠ΅Π½ΠΈΡ ΠΏΠΎΡΠ΅Π½ΡΠΈΠ°Π»Π° ΡΠ΅ΡΠΌΠΎΡΠΈΠ»ΡΠ½ΡΡ Π±Π°ΠΊΡΠ΅ΡΠΈΠΉ ΡΠΈΠΏΠ°Clostridium thermocellum ΠΈ Clostridium thermosaccharoliticum, ΠΊΠΎΡΠΎΡΡΠ΅ ΠΏΡΠΎΠ΄ΡΡΠΈΡΡΡΡ ΡΠ²ΠΎΠΈ Π°ΠΊΡΠΈΠ²Π½ΡΠ΅ ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»Π»Π°Π·Ρ ΠΈ Π³Π΅ΠΌΠΈΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»ΠΎΠ·Ρ Π΄Π»Ρ ΠΏΠ΅ΡΠ΅ΡΠ°Π±ΠΎΡΠΊΠΈ ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»ΠΎΠ·Ρ ΠΏΡΠΈ Π²ΡΡΠΎΠΊΠΈΡ Π΄ΠΎ 600Π‘ ΡΠ΅ΠΌΠΏΠ΅ΡΠ°ΡΡΡΠ°Ρ . ΠΠ΄Π½Π°ΠΊΠΎ ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»Π°Π·Π½ΡΠ΅ ΡΠΈΡΡΠ΅ΠΌΡ ΡΡΠΈΡ Π±Π°ΠΊΡΠ΅ΡΠΈΠΉ ΠΈΠΌΠ΅ΡΡ Π΄ΠΎΡΡΠ°ΡΠΎΡΠ½ΠΎ ΡΠ»ΠΎΠΆΠ½ΡΠΉ ΠΌΠ΅Ρ Π°Π½ΠΈΠ·ΠΌ ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΠ°ΡΠΈΠΈ ΠΈ ΠΏΠΎΡΡΠΎΠΌΡ Π² Π½Π°ΡΡΠΎΡΡΠ΅Π΅ Π²ΡΠ΅ΠΌΡ Π³ΠΎΠ²ΠΎΡΠΈΡΡ ΠΎΠ± ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠΈ ΡΡΠΈΡ ΡΠΈΡΡΠ΅ΠΌ Π² ΠΏΡΠΎΠΌΡΡΠ»Π΅Π½Π½ΠΎΠΌ ΠΏΡΠΎΠΈΠ·Π²ΠΎΠ΄ΡΡΠ²Π΅ Π±ΠΈΠΎΡΡΠ°Π½ΠΎΠ»Π° ΠΏΡΠ΅ΠΆΠ΄Π΅Π²ΡΠ΅ΠΌΠ΅Π½Π½ΠΎ. ΠΠ°ΠΈΠ±ΠΎΠ»Π΅Π΅ ΠΎΡΡΠ°Π±ΠΎΡΠ°Π½Π½ΡΠΌΠΈ ΡΠ΅Π³ΠΎΠ΄Π½Ρ ΡΠ²Π»ΡΡΡΡΡ ΡΠΈΡΡΠ΅ΠΌΡ (ΠΊΠΎΠ½ΡΡΡΡΠΊΡΠΈΠΈ) ΠΏΠ΅ΡΠ΅ΡΠ°Π±ΠΎΡΠΊΠΈ ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»ΠΎΠ·Ρ, Π² ΠΊΠΎΡΠΎΡΡΡ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΡΡΡΡΡ Π³Π΅Π½Ρ ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»ΠΎΠ»ΠΈΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΈΡ ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΠΎΠ², Π²ΡΠ΄Π΅Π»Π΅Π½Π½ΡΠ΅ ΠΈΠ· Π³ΡΠΈΠ±ΠΎΠ² Π² ΠΎΡΠ½ΠΎΠ²Π½ΠΎΠΌ ΠΈΠ· ΡΡΠ°ΠΌΠΌΠ° Π³ΡΠΈΠ±ΠΎΠ² Lentinulla edodes (Shiitake) ΠΈ Trichoderma reesei.
Π Π½Π°ΡΡΠΎΡΡΠ΅ΠΌΡ Π²ΡΠ΅ΠΌΠ΅Π½ΠΈ ΡΡΡΠ°Π½ΠΎΠ²Π»Π΅Π½ΠΎ, ΡΡΠΎ ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½Ρ, ΠΈΠ·Π²Π΅ΡΡΠ½ΡΠΉ ΠΊΠ°ΠΊ «cellulase» Π΄Π΅ΠΉΡΡΠ²ΠΈΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎ ΡΠ²Π»ΡΠ΅ΡΡΡ ΠΊΠΎΠΌΠΏΠ»Π΅ΠΊΡΠΎΠΌ ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΠΎΠ² (ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»ΠΎΠ·Π½Π°Ρ ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΠ½Π°Ρ ΡΠΈΡΡΠ΅ΠΌΠ°), Π² ΠΊΠΎΡΠΎΡΡΠΉ Π²Ρ ΠΎΠ΄ΠΈΡ ΡΡΠΈ ΠΎΡΠ½ΠΎΠ²Π½ΡΡ ΠΊΠΎΠΌΠΏΠΎΠ½Π΅Π½ΡΠ° Π΄Π»Ρ ΠΏΠ΅ΡΠ΅ΡΠ°Π±ΠΎΡΠΊΠΈ Π½Π°ΡΠΈΠ²Π½ΠΎΠΉ ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»ΠΎΠ·Ρ.
- Β· ΠΠ½Π΄ΠΎΠ³Π»ΡΠΊΠ°Π½Π°Π·Ρ (endo-Π―-glucanase (EC 3.2.1.4) — ΡΠ»ΡΡΠ°ΠΉΠ½ΡΠ΅ (Π½Π΅ ΡΠ΅Π»Π΅Π²ΡΠ΅) Π΄Π΅ΠΉΡΡΠ²ΠΈΡ Π½Π° ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠΈΠΌΡΠ΅ ΠΈ ΠΏΠΎΠ»ΠΈΡΠ°Ρ Π°ΡΠΈΠ΄Π½ΡΠ΅ ΡΠ΅ΠΏΠΈ.
- Β· ΠΠΊΠ·ΠΎΠ³Π»ΡΠΊΠ°Π½Π°Π·Ρ (exo-Π―-glucanase (EC 3.2.1.91) — Π²ΠΊΠ»ΡΡΠ°ΡΡ ΡΠ΅Π»Π»ΠΎΠ±ΠΈΠΎΠ³ΠΈΠ΄ΡΠΎΠ»Π°Π·Ρ (cellobiohydrolases), ΠΊΠΎΡΠΎΡΡΠ΅ ΠΎΡΡΠ΅ΠΏΠ»ΡΡΡ ΡΠ΅Π»Π»ΠΎΠ±ΠΈΠΎΠ·Ρ ΠΈΠ»ΠΈ Π³Π»ΡΠΊΠΎΠ·Ρ ΠΎΡ ΠΊΠΎΠ½ΡΠΎΠ² ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»ΠΎΠ·Π½ΠΎΠΉ ΡΠ΅ΠΏΠΎΡΠΊΠΈ.
- Β· Π-Π³Π»ΡΠΊΠΎΠ·ΠΈΠ΄Π°Π·Ρ — (Π―-glucosidase (EC 3.2.1.21), ΠΊΠΎΡΠΎΡΡΠ΅ ΠΎΡΠ²ΠΎΠ±ΠΎΠΆΠ΄Π°ΡΡ D-Π³Π»ΡΠΊΠΎΠ·Ρ ΠΎΡ Π΄ΠΈΠΌΠ΅ΡΠΎΠ² ΡΠ΅Π»Π»ΠΎΠ±ΠΈΠΎΠ·Ρ ΠΈ ΡΠΊΠ·ΠΎΠ³Π»ΡΠΊΠΎΠ·ΠΈΠ΄Π°Π·Ρ (exoglucosidases), ΠΊΠΎΡΠΎΡΡΠ΅ ΠΏΡΠ΅Π΄ΠΏΠΎΡΡΠΈΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎ Π³ΠΈΠ΄ΡΠΎΠ»ΠΈΠ·ΠΈΡΡΡΡ ΡΠ°ΡΡΠ²ΠΎΡΠΈΠΌΡΠ΅ ΡΠ΅Π»Π»ΠΎΠ΄Π΅ΠΊΡΡΡΠΈΠ½Ρ.
ΠΠ°ΠΊ ΠΏΠΎΠΊΠ°Π·Π°Π»Π° ΠΏΡΠ°ΠΊΡΠΈΠΊΠ°, ΠΎΠ΄Π½Π° ΠΈΠ· Π°ΠΊΡΠΈΠ²Π½ΡΡ ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»ΠΎΠ·Π½ΡΡ ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΠ½ΡΡ ΡΠΈΡΡΠ΅ΠΌ ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠΈΡΡΡ Π² ΡΡΠ°ΠΌΠΌΠ°Ρ Π³ΡΠΈΠ±Π° Lentinulla edodes (Shiitake). ΠΡΠΎ ΡΠΊΠΎΠ½ΠΎΠΌΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΈ Π²Π°ΠΆΠ½Π°Ρ Π³ΡΡΠΏΠΏΠ° Π³ΡΠΈΠ±ΠΎΠ², ΠΊΠΎΡΠΎΡΠ°Ρ ΠΈΠ·Π΄Π°Π½Π° ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΡΠ΅ΡΡΡ Π² ΠΏΠΈΡΠ΅ ΠΈ Π² ΠΌΠ΅Π΄ΠΈΡΠΈΠ½Π΅. Π’ΡΠ°Π΄ΠΈΡΠΈΠΎΠ½Π½ΠΎ Π³ΡΠΈΠ±Ρ Π²ΡΡΠ°ΡΠΈΠ²Π°ΡΡ Π½Π° ΡΠ²Π΅ΠΆΠΈΡ ΠΎΠ±ΡΠ΅Π·ΠΊΠ°Ρ Π΄ΡΠ΅Π²Π΅ΡΠΈΠ½Ρ. ΠΡΠΈΠ±Ρ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΡΠ΅Ρ Π² ΠΊΠ°ΡΠ΅ΡΡΠ²Π΅ ΠΏΠΈΡΠ°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΡΡ Π²Π΅ΡΠ΅ΡΡΠ² ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»ΠΎΠ·Ρ ΠΈ Π³Π΅ΠΌΠΈΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»ΠΎΠ·Ρ, ΠΈΠ·Π²Π»Π΅ΠΊΠ°Ρ ΠΈΡ ΠΈΠ· Π³Π½ΠΈΡΡΠ΅ΠΉ Π΄ΡΠ΅Π²Π΅ΡΠΈΠ½Ρ. Π’Π°ΠΊΠΈΠΌ ΠΎΠ±ΡΠ°Π·ΠΎΠΌ, ΡΠ°Π·Π½ΠΎΠΎΠ±ΡΠ°Π·ΠΈΠ΅ ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΠΎΠ², ΠΏΡΠΎΠ΄ΡΡΠΈΡΡΠ΅ΠΌΡΡ Π³ΡΠΈΠ±Π°ΠΌΠΈ, ΠΌΠΎΠΆΠ΅Ρ Π±ΡΡΡ ΡΡΠΏΠ΅ΡΠ½ΠΎ ΠΈΡΠΏΠΎΠ»ΡΠ·ΠΎΠ²Π°Π½ΠΎ Π΄Π»Ρ ΠΏΠ΅ΡΠ΅ΡΠ°Π±ΠΎΡΠΊΠΈ Π±ΠΈΠΎΠΌΠ°ΡΡΡ Ρ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΡΡΡΠΈΠΌ ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½ΠΈΠ΅ΠΌ Π±ΠΈΠΎΡΡΠ°Π½ΠΎΠ»Π°. ΠΠ° ΡΠ΅Π³ΠΎΠ΄Π½Ρ ΡΠΆΠ΅ ΠΊΠ»ΠΎΠ½ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½Ρ 2 ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»Π°Π·Π½ΡΡ Π³Π΅Π½Π° ΠΈΠ· ΡΡΠ°ΠΌΠΌΠ° ΡΡΠΎΠ³ΠΎ Π³ΡΠΈΠ±Π° (cel 7A ΠΈcel 6B). ΠΠΏΠΈΡΠ°Π½Π° ΡΠΊΡΠΏΡΠ΅ΡΡΠΈΡ ΡΡΠΈΡ Π³Π΅Π½ΠΎΠ² Π΄Π»Ρ ΡΠ°Π·Π»ΠΈΡΠ½ΡΡ ΠΈΡΡΠΎΡΠ½ΠΈΠΊΠΎΠ² ΡΠ³Π»Π΅ΡΠΎΠ΄Π° ΠΈ ΠΏΡΠΎΠ΄Π΅ΠΌΠΎΠ½ΡΡΡΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΎ, ΡΡΠΎ ΠΎΠ±Π° Π³Π΅Π½Π° Π°ΠΊΡΠΈΠ²ΠΈΠ·ΠΈΡΡΡΡΡΡ Π² ΠΏΡΠΈΡΡΡΡΡΠ²ΠΈΠΈ ΠΊΡΠΈΡΡΠ°Π»Π»ΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΎΠΉ ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»ΠΎΠ·Ρ.
ΠΠ»Ρ ΠΎΠ±Π΅ΡΠΏΠ΅ΡΠ΅Π½ΠΈΡ ΠΊΠΎΠ½ΡΡΠΎΠ»ΠΈΡΡΠ΅ΠΌΠΎΠ³ΠΎ ΡΠΈΠ½ΡΠ΅Π·Π° Π½Π°ΠΌ Π½Π΅ΠΎΠ±Ρ ΠΎΠ΄ΠΈΠΌ Π±ΡΠ» ΠΌΠΈΠ½ΠΈΠΌΠ°Π»ΡΠ½ΡΠΉ 35S-ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡ, ΠΊΠΎΡΠΎΡΡΠΉ ΡΠ°ΠΌ ΠΏΠΎ ΡΠ΅Π±Π΅ Π½Π΅ ΠΌΠΎΠΆΠ΅Ρ ΠΎΠ±Π΅ΡΠΏΠ΅ΡΠΈΠ²Π°ΡΡ ΡΠΊΡΠΏΡΠ΅ΡΡΠΈΡ Π³Π΅Π½Π°, ΠΏΠ΅ΡΠ΅Π΄ ΠΊΠΎΡΠΎΡΡΠΌ ΠΎΠ½ Π½Π°Ρ ΠΎΠ΄ΠΈΡΡΡ. ΠΠ»Ρ ΡΠΊΡΠΏΡΠ΅ΡΡΠΈΠΈ Π΅ΠΌΡ Π½Π΅ΠΎΠ±Ρ ΠΎΠ΄ΠΈΠΌ Π½Π΅ΠΊΠΈΠΉ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΠ½ΠΈΠΊ (helper). Π ΠΊΠ°ΡΠ΅ΡΡΠ²Π΅ ΡΠ°ΠΊΠΎΠ³ΠΎ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΠ½ΠΈΠΊΠ° Π½Π°ΠΌΠΈ Π±ΡΠ» Π²ΡΠ±ΡΠ°Π½Π° ΠΊΠ°ΡΡΠ΅ΡΠ° ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Ρ pSGH2, ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°ΡΠ°Ρ Π²ΠΎΡΡΠΌΠΈΠΊΡΠ°ΡΠ½ΡΠΉ Π±ΠΈΠ½Π°ΠΏΡΠ°Π²Π»Π΅Π½Π½ΡΠΉ ΠΏΠΎΠ²ΡΠΎΡ ΠΎΠ±Π»Π°ΡΡΠΈ ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡΠ° ΡΠ΅ΠΏΠ»ΠΎΠ²ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠΎΠΊΠ° (8Ρ HSE). ΠΠΎ ΠΎΠ±Π΅ΠΈΠΌ ΡΡΠΎΡΠΎΠ½Π°ΠΌ ΡΡΠΎΠ³ΠΎ ΡΠ»Π΅ΠΌΠ΅Π½ΡΠ° Π½Π°Ρ ΠΎΠ΄ΠΈΡΡΡ Π’ΠΠ’Π Π±ΠΎΠΊΡΡ, ΠΏΠ΅ΡΠ΅Π΄ ΡΠ»Π΅ΠΌΠ΅Π½ΡΠΎΠΌ «8Ρ HSE» Π½Π°Ρ ΠΎΠ΄ΠΈΡΡΡ ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡΡ T7 ΠΈ Sp6. Π Π΄Π°Π½Π½ΡΡ ΠΊΠ°ΡΡΠ΅ΡΡ ΠΏΠΎ ΡΠ°ΠΉΡΠ°ΠΌ ΡΠ΅ΡΡΡΠΈΠΊΡΠΈΠΈ ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΠΎΠ² BamHI ΠΈ SalI Π±ΡΠ» ΠΊΠ»ΠΎΠ½ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ ΠΌΠΈΠ½ΠΈΠΌΠ°Π»ΡΠ½ΡΠΉ 35S-ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡ.
Π ΡΠ²ΡΠ·ΠΈ Ρ ΡΡΠΈΠΌ Π² Π½Π°ΡΠΈΡ ΡΠΊΡΠΏΠ΅ΡΠΈΠΌΠ΅Π½ΡΠ°Ρ Π±ΡΠ»ΠΈ ΡΠΎΠ·Π΄Π°Π½Ρ ΡΠ»Π΅Π΄ΡΡΡΠΈΠ΅ ΠΊΠΎΠ½ΡΡΡΡΠΊΡΠΈΠΈ:
ΠΠ΅ΡΠ²Π°Ρ ΠΊΠΎΠ½ΡΡΡΡΠΊΡΠΈΡ, (ΠΊΠΎΠ½ΡΡΠΎΠ»Ρ) — HSE-35Smin-GUS-NOS-pCAMBIA, Π½Π΅ ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°ΡΠ°Ρ Π½ΠΈΠΊΠ°ΠΊΠΈΡ ΡΡΠ°Π½ΡΠ»ΡΡΠΈΠΎΠ½Π½ΡΡ ΡΠ½Ρ Π°Π½ΡΠ΅ΡΠ½ΡΡ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΠ΅ΠΉ, Π±ΡΠ»Π° ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½Π° ΠΏΡΡΠ΅ΠΌ Π²ΡΡΠ°Π²ΠΊΠΈ Π² ΠΏΡΡΡΡΡ ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Ρ pCAMBIA, ΠΊΠ°ΡΡΠ΅ΡΡ Ρ ΡΠ»Π΅ΠΌΠ΅Π½ΡΠΎΠΌ ΡΠ΅ΠΏΠ»ΠΎΠ²ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠΎΠΊΠ° ΠΈ ΠΌΠΈΠ½ΠΈΠΌΠ°Π»ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ 35S-ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡΠ° Π²ΠΈΡΡΡΠ° ΠΌΠΎΠ·Π°ΠΈΠΊΠΈ ΡΠ²Π΅ΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΊΠ°ΠΏΡΡΡΡ, ΡΠ΅ΠΏΠΎΡΡΠ΅ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ Π³Π΅Π½Π°, ΠΊΠΎΠ΄ΠΈΡΡΡΡΠ΅Π³ΠΎ ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½Ρ Π²-Π³Π»ΡΠΊΡΡΠΎΠ½ΠΈΠ΄Π°Π·Ρ (GUS) ΠΈ ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΎΡ Π½ΠΎΠΏΠ°Π»ΠΈΠ½ ΡΠΈΠ½ΡΠ°Π·Ρ (NOS-terminator), ΠΎΡΠ²Π΅ΡΡΡΠ²Π΅Π½Π½ΠΎΠ³ΠΎ Π·Π° ΡΠΈΠ³Π½Π°Π» ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠ°Π΄Π΅Π½ΠΈΠ»ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ (ΡΠ»Π΅ΠΌΠ΅Π½Ρ ΠΌΠ ΠΠ ΡΠ°ΡΡΠ΅Π½ΠΈΠΉ, Π·Π°ΡΠΈΡΠ°ΡΡΠΈΠΉ ΠΎΡ ΡΠΈΠ±ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅Π°Π· ΠΈ ΠΏΡΠΎΡΠ²Π»ΡΡΡΠΈΠΉ Π½Π΅ΠΊΠΈΠΉ ΡΠ½Ρ Π°Π½ΡΠ΅ΡΠ½ΡΠΉ ΡΡΡΠ΅ΠΊΡ).
ΠΡΠΎΡΠ°Ρ ΠΊΠΎΠ½ΡΡΡΡΠΊΡΠΈΡ — HSE-35Smin-115×3-GUS-TMV-NOS-pCAMBIA Π±ΡΠ»Π° ΡΠ°Π½Π΅Π΅ ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½Π° Ρ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΡΡ Π²ΡΡΠ°Π²ΠΊΠΈ Π² ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Ρ pl-GUS ΠΏΠΎ ΡΠ΅ΡΡΡΠΈΠΊΡΠΈΠΎΠ½Π½ΡΠΌ ΡΠ°ΠΉΡΠ°ΠΌ HindIII ΠΈ NcoI ΠΠΠ ΡΡΠ°Π³ΠΌΠ΅Π½ΡΠ°, ΠΊΠΎΡΠΎΡΡΠΉ ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠΈΡ ΡΡΠ΅Ρ ΠΊΡΠ°ΡΠ½ΡΠΉ ΠΏΠΎΠ²ΡΠΎΡ 10 Π½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄Π½ΠΎΠΉ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΠΈ ΠΏΠΎΠ²ΡΠΎΡΡΡΡΠΈΠΉ Π²Π½ΡΡΡΠ΅Π½Π½ΠΈΠΉ ΡΠ°ΠΉΠΎΠ½ 18S ΡΠ ΠΠ ΡΠ°ΡΡΠ΅Π½ΠΈΠΉ Ρ 1115 ΠΏΠΎ 1124 Π½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄ (ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΡ ARC-1). ΠΠ°ΡΠ΅ΠΌ ΠΏΠΎ ΡΠ°ΠΉΡΠ°ΠΌ ΡΠ΅ΡΡΡΠΈΠΊΡΠΈΠΈ BamHIΠΈ NdeI Π² 3'-ΠΊΠΎΠ½Π΅Ρ Π±ΡΠ»Π° Π²ΡΡΠ°Π²Π»Π΅Π½Π° 3'-Π½Π΅ΡΡΠ°Π½ΡΠ»ΠΈΡΡΠ΅ΠΌΡΡ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΡ Π²ΠΈΡΡΡΠ° ΡΠ°Π±Π°ΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΌΠΎΠ·Π°ΠΈΠΊΠΈ (TMV). ΠΠ»Ρ ΠΏΡΠΈΠ±Π»ΠΈΠΆΠ΅Π½ΠΈΡ ΠΌΠ ΠΠ ΠΊ ΡΠ°ΡΡΠΈΡΠ΅Π»ΡΠ½ΡΠΌ, ΠΏΠΎ ΡΠ°ΠΉΡΠ°ΠΌ NdeI ΠΈ EcoRI Π² ΠΊΠ°cΡΠ΅ΡΡ 115×3-GUS-TMV Π±ΡΠ» Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»Π΅Π½ ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΎΡ Π½ΠΎΠΏΠ°Π»ΠΈΠ½ ΡΠΈΠ½ΡΠ°Π·Ρ (NOSterminator), ΠΎΡΠ²Π΅ΡΡΡΠ²Π΅Π½Π½ΡΠΉ Π·Π° ΡΠΈΠ³Π½Π°Π» ΠΏΠΎΠ»ΠΈΠ°Π΄Π΅Π½ΠΈΠ»ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ.
Π’ΡΠ΅ΡΡΡ ΠΊΠΎΠ½ΡΡΡΡΠΊΡΠΈΡ — HSE-35Smin-115×3-Cell7A-TMV-NOS-pCAMBIA Π±ΡΠ»Π° ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½Π° Ρ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΡΡ Π·Π°ΠΌΠ΅Π½Ρ ΡΠ΅ΠΏΠΎΡΡΠ΅ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ Π³Π΅Π½Π° GUS ΠΏΠΎ ΡΠ°ΠΉΡΠ°ΠΌ ΡΠ΅ΡΡΡΠΈΠΊΡΠΈΠΈ NcoI ΠΈ Cfr9I Π½Π° Π³Π΅Π½ ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»Π°Π·Ρ 7Π ΠΈΠ· Π³ΡΠΈΠ±Π° Lentinulaedodes (ΡΠΈΡΡΠ½ΠΎΠΊ 1).
Π — ΠΊΠΎΠ½ΡΡΠΎΠ»Ρ, ΡΠΎΡΡΠΎΡΡΠΈΠΉ ΠΈΠ· ΡΠ»Π΅ΠΌΠ΅Π½ΡΠ° ΡΠ΅ΠΏΠ»ΠΎΠ²ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠΎΠΊΠ° (HSE), ΠΌΠΈΠ½ΠΈΠΌΠ°Π»ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ 35S CaMV-ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡΠ°, ΡΠ΅ΠΏΠΎΡΡΠ΅ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ Π³Π΅Π½Π° (GUS) ΠΈ ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΎΡΠ° Π½ΠΎΠΏΠ°Π»ΠΈΠ½ ΡΠΈΠ½ΡΠ°Π·Ρ (NOS). Π — ΠΊΠΎΠ½ΡΡΡΡΠΊΡΠΈΡ, ΠΎΡΠ»ΠΈΡΠ°ΡΡΠ°ΡΡΡ ΠΎΡ ΠΊΠΎΠ½ΡΡΠΎΠ»Ρ ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°Π½ΠΈΠ΅ΠΌ ΡΠ½Ρ Π°Π½ΡΠ΅ΡΠ½ΠΎΠΉ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΠΈ (3Ρ ARC-1), Π — ΠΊΠΎΠ½ΡΡΡΡΠΊΡΠΈΡ, Π² ΠΊΠΎΡΠΎΡΠΎΠΉ ΡΠ΅ΠΏΠΎΡΡΠ΅ΡΠ½ΡΠΉ Π³Π΅Π½ GUSΠ±ΡΠ» Π·Π°ΠΌΠ΅Π½Π΅Π½ Π½Π° Π³Π΅Π½ ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΠ° ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»Π°Π·Ρ ΠΈΠ· Π³ΡΠΈΠ±Π° Lentinulaedodes;
ΠΠΎΠ½ΡΡΡΡΠΊΡΠΈΠΈ, ΡΠ°Π·Π»ΠΈΡΠ°ΡΡΠΈΠ΅ΡΡ ΠΏΠΎ Π½Π°Π»ΠΈΡΠΈΡ ΠΈΠ»ΠΈ ΠΎΡΡΡΡΡΡΠ²ΠΈΡ ΡΠ½Ρ Π°Π½ΡΠ΅ΡΠ½ΡΡ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΠ΅ΠΉ Π±ΡΠ»ΠΈ ΠΊΠ»ΠΎΠ½ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½Ρ Π² Π±ΠΈΠ½Π°ΡΠ½ΡΡ ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Ρ pCAMBIA2300.
ΠΡΠΎΠ²Π΅ΡΠΊΠ° ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄ Π½Π° Π½Π°Π»ΠΈΡΠΈΠ΅ ΠΈΠ½ΡΠ΅ΡΠ΅ΡΡΡΡΠΈΡ Π½Π°Ρ ΠΠΠ-ΡΡΠ°Π³ΠΌΠ΅Π½ΡΠΎΠ², ΠΎΡΡΡΠ΅ΡΡΠ²Π»ΡΠ»Π°ΡΡ ΠΌΠ΅ΡΠΎΠ΄ΠΎΠΌ ΡΠ΅ΡΡΡΠΈΠΊΡΠΈΠΈ.
ΠΡΠΎΠ²Π΅ΡΠΊΠ° ΠΊΠΎΠ½ΡΡΡΡΠΊΡΠΈΠΈ HSE-35Smin-GUS-NOS-pCAMBIA (ΠΊΠΎΠ½ΡΡΠΎΠ»Ρ) Π±ΡΠ»Π° ΠΏΡΠΎΠ²Π΅Π΄Π΅Π½Π° Ρ ΠΌΠ΅ΡΠΎΠ΄ΠΎΠΌ ΠΎΠ±ΡΠ°Π±ΠΎΡΠΊΠΈ ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Ρ ΡΠ΅ΡΡΡΠΈΠΊΡΠ°Π·Π°ΠΌΠΈ HindIII ΠΈ NcoI. Π ΡΡΠΎΠΌ ΡΠ»ΡΡΠ°Π΅ ΠΈΠ· Π΄Π°Π½Π½ΠΎΠΉ ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Ρ ΠΌΡ Π²ΡΡΠ΅Π·Π°Π»ΠΈ ΠΊΠ°ΡΡΠ΅ΡΡ, ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°ΡΡΡ ΡΠ»Π΅ΠΌΠ΅Π½Ρ ΡΠ΅ΠΏΠ»ΠΎΠ²ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠΎΠΊΠ° ΠΈ ΠΌΠΈΠ½ΠΈΠΌΠ°Π»ΡΠ½ΡΠΉ 35S-ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡ. ΠΠ»ΠΈΠ½Π° Π΄Π°Π½Π½ΠΎΠ³ΠΎ ΡΡΠ°Π³ΠΌΠ΅Π½ΡΠ° ΠΏΡΠΈΠΌΠ΅ΡΠ½ΠΎ 550 ΠΏΠ°Ρ ΠΎΡΠ½ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΠΉ (ΠΏ.ΠΎ.). ΠΏΠΎΡΠΊΠΎΠ»ΡΠΊΡ Π² Π΄Π°Π½Π½ΠΎΠΉ ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Π΅ ΠΈΠΌΠ΅ΡΡΡΡ Π΄Π²Π° ΡΠ°ΠΉΡΠ° ΡΠ΅ΡΡΡΠΈΠΊΡΠΈΠΈ NcoI, Π΄ΠΎΠΏΠΎΠ»Π½ΠΈΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎ Π²ΡΡΠ΅Π·Π°Π΅ΡΡΡ ΡΡΠ°Π³ΠΌΠ΅Π½Ρ Π΄Π»ΠΈΠ½ΠΎΡ 3500 ΠΏ.ΠΎ., ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°ΡΠΈΠΉ ΡΠ΅ΠΏΠΎΡΡΠ΅ΡΠ½ΡΠΉ Π³Π΅Π½ Π²-Π³Π»ΡΠΊΡΡΡΠ½ΠΈΠ΄Π°Π·Ρ (GUS), ΡΠ΅ΡΠΌΠΈΠ½Π°ΡΠΎΡ Π½ΠΎΠΏΠ°Π»ΠΈΠ½ ΡΠΈΠ½ΡΠ°Π·Ρ (NOS-ter) ΠΈ ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡ Π½ΠΎΠΏΠ°Π»ΠΈΠ½ ΡΠΈΠ½ΡΠ°Π·Ρ (NOS-pro), ΠΎΡΠ²Π΅ΡΡΡΠ²Π΅Π½Π½ΡΠΉ Π·Π° ΡΠΊΡΠΏΡΠ΅ΡΡΠΈΡ ΠΌΠ°ΡΠΊΠ΅ΡΠ½ΠΎΠ³ΠΎ Π³Π΅Π½Π° (ΡΡΡΠΎΠΉΡΠΈΠ²ΠΎΡΡΡ ΠΊ ΠΊΠ°Π½Π°ΠΌΠΈΡΠΈΠ½Ρ).
ΠΠΎΠ½ΡΡΡΡΠΊΡΠΈΡ HSE-35Smin-115×3-GUS-TMV-NOS-pCAMBIA Π±ΡΠ»Π° ΠΏΡΠΎΠ²Π΅ΡΠ΅Π½Π° Ρ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΡΡ ΡΠ½Π΄ΠΎΠ½ΡΠΊΠ»Π΅Π°Π· HindIII ΠΈ NcoI. ΠΠ°Π½Π½ΠΎΠΉ ΠΊΠΎΠ½ΡΡΡΡΠΊΡΠΈΠΈ ΡΠ»Π΅ΠΌΠ΅Π½Ρ ΡΠ΅ΠΏΠ»ΠΎΠ²ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠΎΠΊΠ°, ΠΌΠΈΠ½ΠΈΠΌΠ°Π»ΡΠ½ΡΠΉ 35S-ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡ ΠΈ ΡΠ½Ρ Π°Π½ΡΠ΅ΡΠ½Π°Ρ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΡ ΠΎΠ±ΡΠ΅Π΄ΠΈΠ½Π΅Π½Ρ Π² ΠΎΠ΄ΠΈΠ½ ΡΡΠ°Π³ΠΌΠ΅Π½Ρ, ΠΏΡΠΎΠ΄ΡΠΊΡ ΡΠ΅ΡΡΡΠΈΠΊΡΠΈΠΈ Π΄ΠΎΠ»ΠΆΠ΅Π½ Π±ΡΡΡ ΠΏΠΎΡΡΠ΄ΠΊΠ° 650 ΠΏ.ΠΎ. (HSE-35Smin — 550 ΠΏ.ΠΎ., 115×3 — 80 ΠΏ.ΠΎ.).
Π’ΡΠ΅ΡΡΡ ΠΊΠΎΠ½ΡΡΡΡΠΊΡΠΈΡ HSE-35Smin-115×3-Cell7A-TMV-NOS-pCAMBIA Π±ΡΠ»Π° ΠΎΠ±ΡΠ°Π±ΠΎΡΠ°Π½Π° ΡΠ΅ΡΡΡΠΈΠΊΡΠ°Π·Π°ΠΌΠΈ HindIII ΠΈ NcoI Π΄Π»Ρ Π²ΡΡΠ΅Π·Π°Π½ΠΈΡ ΡΡΠ°Π³ΠΌΠ΅Π½ΡΠ° HSE-35Smin-115×3. Π ΡΠ΅ΡΡΡΠΈΠΊΡΠΈΠΎΠ½Π½ΡΡ ΡΠΌΠ΅ΡΡ Π±ΡΠ» Π΄ΠΎΠ±Π°Π²Π»Π΅Π½ ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½Ρ Cfr9I Π΄Π»Ρ Π²ΡΡΠ΅Π·Π°Π½ΠΈΡ Π³Π΅Π½Π° ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»Π°Π·Ρ 7Π Π΄Π»ΠΈΠ½Π½ΠΎΡ Π² 1571 ΠΏ.ΠΎ.
Π Π΅Π·ΡΠ»ΡΡΠ°ΡΡ ΡΠ΅ΡΡΡΠΈΠΊΡΠΈΠΈ Π±ΡΠ»ΠΈ ΠΏΡΠΎΠ°Π½Π°Π»ΠΈΠ·ΠΈΡΠΎΠ²Π°Π½Ρ Ρ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΡΡ Π³Π΅Π»Ρ-ΡΠ»Π΅ΠΊΡΡΠΎΡΠΎΡΠ΅Π·Π° Π² 1% Π°Π³Π°ΡΠΎΠ·Π½ΠΎΠΌ Π³Π΅Π»Π΅ (ΡΠΈΡΡΠ½ΠΎΠΊ 2).
ΡΠ΅ΡΡΡΠΈΠΊΡΠΈΠΎΠ½Π½ΡΠΉ Π³ΠΈΠ΄ΡΠΎΠ»ΠΈΠ· ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»ΠΎΠ·Π° ΡΠ΅ΡΠΌΠ΅Π½ΡΠ°ΡΠΈΠ²Π½ΡΠΉ ΠΠ· ΡΠΈΡΡΠ½ΠΊΠ° 2 Π²ΠΈΠ΄Π½ΠΎ, ΡΡΠΎ Π² ΡΠ»ΡΡΠ°Π΅ ΠΊΠΎΠ½ΡΡΠΎΠ»Ρ ΡΠ»Π΅ΠΌΠ΅Π½Ρ ΡΠ΅ΠΏΠ»ΠΎΠ²ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠΎΠΊΠ° ΠΈ ΠΌΠΈΠ½ΠΈΠΌΠ°Π»ΡΠ½ΡΠΉ 35S-ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡ ΠΈΠΌΠ΅ΡΡ Π΄Π»ΠΈΠ½Ρ Π² 550 ΠΏ.ΠΎ. Π ΡΠ»ΡΡΠ°Π΅, Π³Π΄Π΅ ΠΏΡΠΈΡΡΡΡΡΠ²ΡΠ΅Ρ ΡΠ½Ρ Π°Π½ΡΠ΅ΡΠ½Π°Ρ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΡ 115×3, Π΄Π»ΠΈΠ½Π° ΡΡΠ°Π³ΠΌΠ΅Π½ΡΠ° ΡΠ²Π΅Π»ΠΈΡΠΈΠ»Π°ΡΡ ΠΈ ΡΠΎΡΡΠ°Π²Π»ΡΠ΅Ρ ΠΏΠΎΡΡΠ΄ΠΊΠ° 650 Π½ΡΠΊΠ»Π΅ΠΎΡΠΈΠ΄ΠΎΠ². ΠΡΠΈ ΡΠ΅ΡΡΡΠΈΠΊΡΠΈΠΎΠ½Π½ΠΎΠΌ Π°Π½Π°Π»ΠΈΠ·Π΅ ΠΊΠΎΠ½ΡΡΡΡΠΊΡΠΈΠΈ HSE-35Smin-115×3-Cell7A-TMV-NOS-pC Π΄Π»ΠΈΠ½Π° ΡΡΠ°Π³ΠΌΠ΅Π½ΡΠ°, ΡΠΎΠ΄Π΅ΡΠΆΠ°ΡΠΈΠΉ ΡΠ»Π΅ΠΌΠ΅Π½Ρ ΡΠ΅ΠΏΠ»ΠΎΠ²ΠΎΠ³ΠΎ ΡΠΎΠΊΠ°, ΠΌΠΈΠ½ΠΈΠΌΠ°Π»ΡΠ½ΡΠΉ 35S-ΠΏΡΠΎΠΌΠΎΡΠΎΡ ΠΈ ΡΠ½Ρ Π°Π½ΡΠ΅ΡΠ½ΡΡ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΡ 115×3 ΡΠΎΡΡΠ°Π²Π»ΡΠ΅Ρ 650 ΠΏ.ΠΎ., ΠΈ ΠΈΠ· ΠΏΠ»Π°Π·ΠΌΠΈΠ΄Ρ Π±ΡΠ» Π²ΡΡΠ΅Π·Π°Π½ Π³Π΅Π½ ΡΠ΅Π»Π»ΡΠ»Π°Π·Ρ 7Π, Π΄Π»ΠΈΠ½Π½ΠΎΡ 1571 ΠΏ.ΠΎ.
Π ΡΠ΅Π·ΡΠ»ΡΡΠ°ΡΠ΅ ΠΈΡΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°Π½ΠΈΡ Π±ΡΠ»ΠΈ ΠΏΠΎΠ»ΡΡΠ΅Π½Ρ ΠΠΠ-ΠΊΠΎΠ½ΡΡΡΡΠΊΡΠΈΠΈ, ΠΎΠ±Π΅ΡΠΏΠ΅ΡΠΈΠ²Π°ΡΡΠΈΠ΅ Π²ΡΡΠΎΠΊΡΡ ΡΠΊΡΠΏΡΠ΅ΡΡΠΈΡ Π³Π΅Π½Π° ΠΈ Π²ΡΡ ΠΎΠ΄ Π±Π΅Π»ΠΊΠ° ΠΏΡΠΈ ΠΏΠΎΠΌΠΎΡΠΈ ΡΡΠ°Π½ΡΠ»ΡΡΠΈΠΎΠ½Π½ΡΡ ΡΠ½Ρ Π°Π½ΡΠ΅ΡΠ½ΡΡ ΠΏΠΎΡΠ»Π΅Π΄ΠΎΠ²Π°ΡΠ΅Π»ΡΠ½ΠΎΡΡΠ΅ΠΉ.
- 1. ΠΠ°ΡΠ³ΡΠ»ΠΈΡ Π. Π., ΠΡΠΆΠΎΠ²Π° Π. Π. ΠΠ΅Π»ΠΊΠΈ ΡΡΡΠ΅ΡΡΠ° Π² ΡΡΠΊΠ°ΡΠΈΠΎΡΠΈΡΠ΅ΡΠΊΠΎΠΉ ΠΊΠ»Π΅ΡΠΊΠ΅. // Π¦ΠΈΡΠΎΠ»ΠΎΠ³ΠΈΡ, 2001, Π’.42. № 4. C. 323−342.
- 2. Bailey-Serres J., Dawe R.K. Both 5'- and 3'-sequenses of Maize adh-1 mRNA are required for enhanced translation under low oxygen conditions.//Plant physiol., 1996, Vol.112. P. 685−695.
- 3. Nover L., Neumann D., Sharf K-D. Heat shock and other stress response systems of plants// Results and problems in cell differentiation. 1989, Vol.16: P. 156−170.
- 4. Charles C. Lee, Dominic W.S. Wong, George H. Robertson. Cloning and characterization of two cellulase genes from Lentinula edodes and Trichoderma reesei// FEMS Microbiology Letter, 2005 (2001), P.355−360.
- 5. Gallie D.R. The cap and poly (A) tail function synergistically to regulate mRNA translational efficiency // Genes Devel., 1991, Vol.5. -Π .2108−2116.
- 6. R.Zh. Akbergenov, S.Sh. Zhanybekova, R.V. Kryldakov, A. Zhigailov, N.S. Polimbetova, T. Hohn and B.K. Iskakov. ARC-1, a sequence element complementary to an internal 18S rRNA segment, enhances translation efficiency in plants when present in the leader or intercistronic region of mRNAs // Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 1, P. 239−247.
- 7. Maniatis T. et al. Molecular cloning, Book I, 1989.